本期《袁來如此》為系列文章《大分子生物分析概論》的第十三篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，對(duì)評(píng)估藥物臨床前PK/PD時(shí)，開發(fā)和選擇LBA方法的策略作初步介紹。
由于內(nèi)容篇幅較長(zhǎng)，本文將采取上下篇形式進(jìn)行推送，敬請(qǐng)垂注！《袁來如此》專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號(hào)打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。
1.導(dǎo)論
藥物發(fā)現(xiàn)是一個(gè)快速的transformative的過程，其包括靶標(biāo)識(shí)別、靶標(biāo)驗(yàn)證、先導(dǎo)藥物的識(shí)別和優(yōu)化。隨著項(xiàng)目推進(jìn)經(jīng)過這些階段，對(duì)生物分析的需求也在相應(yīng)地改變。開發(fā)合適的生物分析方法可以提供藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)（PK/PD）的寶貴數(shù)據(jù)，以支持在新藥研發(fā)項(xiàng)目不同階段中關(guān)鍵的藥效和安全性研究，從而為項(xiàng)目的進(jìn)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在新藥早期的發(fā)現(xiàn)階段，會(huì)同時(shí)考慮不同藥物模式（drug modalities）的多個(gè)分子。一般有多種模式可供選擇，取決于靶標(biāo)及其位置，例如，傳統(tǒng)的小分子、多肽、單克隆抗體、抗體-藥物偶聯(lián)物、納米抗體、融合蛋白藥物、雙特異性生物藥和寡核苷酸。在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，藥物的快速發(fā)現(xiàn)以及快速開發(fā)正推動(dòng)著生物分析領(lǐng)域的發(fā)展和演進(jìn)。這種演進(jìn)的主要內(nèi)容是，縮短分析運(yùn)行時(shí)間，實(shí)施multiplex分析，提高靈敏度，降低樣品體積的消耗，實(shí)現(xiàn)分析測(cè)試的自動(dòng)化。
本文關(guān)注的重點(diǎn)是臨床前蛋白藥物生物分析方法的開發(fā)策略，即LBA分析平臺(tái)的選擇和方法開發(fā)中的關(guān)鍵注意事項(xiàng)。本系列之前的文章，基本是關(guān)注用于臨床樣本分析的LBA方法。為了簡(jiǎn)單起見，在此文中僅評(píng)估用于檢測(cè)蛋白藥物的sandwich format的LBA，而蛋白藥物在大多數(shù)情況下，意味著單克隆抗體。雖然相關(guān)技術(shù)有多方面的進(jìn)步，本文將重點(diǎn)關(guān)注已經(jīng)商業(yè)化和在生物分析行業(yè)十分流行的技術(shù)。文末的參考可以引導(dǎo)讀者非常詳細(xì)地了解相關(guān)內(nèi)容。
目前最流行的3種技術(shù)是ELISA、電化學(xué)發(fā)光（ECL、MSD、NJ、USA）和Gyrolab®（Gyros Protein Technologies、Uppsala、Sweden）。 同時(shí)，本文會(huì)簡(jiǎn)要地涵蓋以下幾項(xiàng)不經(jīng)常使用但具有超高靈敏度的技術(shù)：如基于Single Molecule Array平臺(tái)（單分子陣列，Simoa™），單分子計(jì)數(shù)[SMC™]的Erenna® 平臺(tái)（Singulex Inc、CA、USA），免疫聚合酶鏈反應(yīng)平臺(tái)（immuno-polymerase chain reaction、immuno-PCR、 Imperacer®、Chimera Biotec GmbH、Dortmund、Germany）。另外，還會(huì)簡(jiǎn)要介紹multiplexing的Luminex平臺(tái)（Luminex xMAPR、Luminex Corporation、TX、USA）。在藥物發(fā)現(xiàn)階段，分析方法開發(fā)是生物分析的主要內(nèi)容之一，同時(shí)，應(yīng)當(dāng)特別考慮評(píng)估耐受性（tolerance）和分子完整性（molecular integrity）。
2.臨床前LBA方法的關(guān)鍵參數(shù)
用于藥物發(fā)現(xiàn)階段的生物分析方法有5個(gè)重要參數(shù)：樣品體積要求，定量的動(dòng)態(tài)范圍，測(cè)試運(yùn)行時(shí)間，靈敏度和自動(dòng)化程度。本文將簡(jiǎn)要地評(píng)估這些參數(shù)，并介紹這些參數(shù)在選擇檢測(cè)平臺(tái)時(shí)發(fā)揮的重要作用。
1) 樣本體積消耗
從小鼠身上單次采集的血清或血漿樣本的體積約為50ml。隨著在動(dòng)物研究中嘗試實(shí)施3R（替換replacement，減少reduction 和細(xì)化refinement ），生物分析業(yè)界正在探索多種微體積采樣方法，而這將進(jìn)一步大幅度地減少樣本體積。另外，在分析小鼠腦脊液等基質(zhì)的樣本時(shí)，只有2-5ml的體積可用?？紤]到有可能意外損失樣本，故從動(dòng)物獲得的樣本體積應(yīng)足以分析樣本至少兩次。因此，應(yīng)當(dāng)首選能夠使用低樣本體積的分析技術(shù)和平臺(tái)。
2) 定量動(dòng)態(tài)范圍
能夠在寬廣的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，至少包含3-4個(gè)數(shù)量級(jí)，進(jìn)行定量分析是極其有益的。對(duì)于PK分析，這允許較高的最小稀釋要求（minimum required dilution，MRD），以盡量減少樣本基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)為低劑量給藥的樣本提供所需的定量靈敏度。同樣，對(duì)于PD，它允許在更寬廣的范圍內(nèi)測(cè)試平行性（parallelism），從而允許對(duì)含有高濃度生物標(biāo)志物的樣品進(jìn)行大幅度的稀釋。對(duì)于生物標(biāo)志物測(cè)量，稀釋還有助于最大限度地減少樣本和基于緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)曲線（替代基質(zhì)）之間的基質(zhì)差異，從而更精確地生成定量數(shù)據(jù)。
3) 分析運(yùn)行時(shí)間
分析運(yùn)行時(shí)間是實(shí)施PK/PD樣本分析所需時(shí)間，假定使用之前已為該應(yīng)用開發(fā)分析方法，這也意味著假定試劑已標(biāo)記，緩沖液已制備，并且相關(guān)儀器也已準(zhǔn)備就緒。在non-GLP臨床前生物分析實(shí)驗(yàn)室中，時(shí)間是至關(guān)重要的；在大多數(shù)情況下，最終目標(biāo)是提供可靠，且可以重現(xiàn)的數(shù)據(jù)，同時(shí)保持較短的分析運(yùn)行時(shí)間。這就提高了實(shí)驗(yàn)室的效率，并允許該部門同時(shí)支持多個(gè)項(xiàng)目。分析96樣本微孔板的運(yùn)行時(shí)間可以在1-5小時(shí)的范圍之間，具體取決于采用的分析技術(shù)（對(duì)于某些分析技術(shù)，有額外的隔夜捕獲步驟overnight capture step）。
4) 靈敏度
大多數(shù)傳統(tǒng)的單克隆抗體的PK定量LLOQ在幾個(gè)ng/ml范圍。一些高效力藥物分子（需要低劑量）和低豐度（或下調(diào)了的）的生物標(biāo)志物可能需要更高的靈敏度。應(yīng)當(dāng)依據(jù)個(gè)案的情況為這些應(yīng)用選擇相應(yīng)的分析平臺(tái)。此外，高靈敏度的分析方法是高度依賴所使用的試劑，因此獲得高特異性和高親和力的試劑可以大大提高定量的靈敏度。提升分析靈敏度也同時(shí)降低了對(duì)樣本體積的要求，見1）。
5) 自動(dòng)化
自動(dòng)化平臺(tái)可縮短分析人員操作的時(shí)間，提高生物分析部門的效率。在臨床前藥物開發(fā)的環(huán)境中，分析平臺(tái)的完全自動(dòng)化，在需要開發(fā)分析方法且進(jìn)行常規(guī)樣本分析的情況下是非常有益的。同時(shí)，對(duì)于方法開發(fā)，優(yōu)化和因基質(zhì)或物種變化而進(jìn)行的方法認(rèn)證，需要能夠修改自動(dòng)化平臺(tái)上的檢測(cè)方法的靈活性。
除了分析測(cè)試自動(dòng)化之外，還可以自動(dòng)化地制備標(biāo)準(zhǔn)品（standards）和質(zhì)量控制樣品（QCs），從而節(jié)省時(shí)間，降低珍貴參照（比）物料（reference material）的使用和成本，并減少手動(dòng)移液產(chǎn)生的誤差。一些分析測(cè)試平臺(tái)，如Gyrolab，允許檢測(cè)的全自動(dòng)化，而Hamilton和HPD300這樣的平臺(tái)，則可以允許自動(dòng)化移液體，或制備標(biāo)準(zhǔn)品和QCs。超高靈敏度的Simoa™平臺(tái)也支持自動(dòng)化地樣本檢測(cè)。
3.臨床前LBA免疫測(cè)試平臺(tái)
目前，有多種LBA測(cè)試平臺(tái)在新藥開發(fā)中得到應(yīng)用。表1列出了若干LBA測(cè)試平臺(tái)及其比較。本文將進(jìn)一步介紹其中幾種在生物分析行業(yè)中應(yīng)用比較廣泛的平臺(tái)。由于為臨床前研究開發(fā)分析方法所選擇的LBA平臺(tái)，很可能會(huì)繼續(xù)在臨床研究中繼續(xù)使用，因此，選擇合適的測(cè)試平臺(tái)，將會(huì)是影響深遠(yuǎn)的一個(gè)重大決定。
表1. 若干LBA測(cè)試平臺(tái)相關(guān)特征的比較
備注：上表中的方法未全部在文中詳細(xì)介紹。
近年來，一系列immunoassay的新技術(shù)，特別是基于微（磁）珠（beads，magnetic，etc.）的技術(shù)，從測(cè)試格式的物理學(xué)/物理化學(xué)層次，待測(cè)物的捕獲，檢測(cè)信號(hào)的收集/放大，數(shù)據(jù)處理等方面，實(shí)現(xiàn)了顯著改善，并取得了相當(dāng)?shù)纳虡I(yè)性成功，雖然這些新方法在化學(xué)和生物學(xué)層次，仍然是基于抗體-抗原的結(jié)合作用以及基本的夾心式immunoassay。本文選擇若干得到廣泛商業(yè)應(yīng)用的測(cè)試平臺(tái)，及其在臨床前生物分析方法開發(fā)的應(yīng)用作初步介紹，希望起到拋磚引玉的目的，引發(fā)更多關(guān)于新的分析測(cè)試技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用的相關(guān)討論、交流和研究。
ELISA平臺(tái)
ELISA是生物制藥行業(yè)內(nèi)外使用最廣泛的配體結(jié)合式（LBA）檢測(cè)平臺(tái)。ELISA的測(cè)試格式包括直接式、間接式和夾心式；ELISA經(jīng)常用作與開發(fā)中的新分析平臺(tái)進(jìn)行比較的基礎(chǔ)；在96孔板上，通常對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)孔（duplicate）測(cè)定，手動(dòng)或半自動(dòng)運(yùn)行。通常使用比色法的檢測(cè)試劑，但有時(shí)也使用其他檢測(cè)試劑，如發(fā)光（luminescence）和熒光（fluorescence）。通常，對(duì)ELISA方法，需要監(jiān)測(cè)試劑，如抗體（antibodies）、配體（ligands）、緩沖液（buffers）以及批次的變化。
幾十年來，傳統(tǒng)的ELISA一直是蛋白質(zhì)定量分析最常用的技術(shù)，因此也是最可靠的技術(shù)之一。即使在今天，大多數(shù)生物標(biāo)志物的商業(yè)檢測(cè)試劑盒都是基于ELISA的。多數(shù)新分析技術(shù)都與作為金標(biāo)準(zhǔn)的ELISA比較。但是，這種分析技術(shù)也有缺點(diǎn)，例如，測(cè)試運(yùn)行時(shí)間約長(zhǎng)為 4-5 小時(shí)，樣品體積消耗大（測(cè)定體積為100 ml），靈敏度低與LLOQ在大多數(shù)情況下接近低-中ng/ml，以及狹窄定量動(dòng)態(tài)范圍（2-3 數(shù)量級(jí)）。這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于某些臨床前生物分析的應(yīng)用仍然很有吸引力，比如血清單克隆抗體的PK。該平臺(tái)還提供了在方法開發(fā)早期階段評(píng)估測(cè)試方法不同部分的靈活性。表2列出了不同檢測(cè)平臺(tái)的性能，以一個(gè)mAb藥物為例。
表2. 與ELISA比色法檢測(cè)相比較，一個(gè)mAb在若干檢測(cè)平臺(tái)上LBA方法參數(shù)的比較
備注：上表中的方法未全部在文中詳細(xì)介紹。
電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence，MSD)平臺(tái)
MSD平臺(tái)是一種基于微孔板的測(cè)試格式，它利用電化學(xué)發(fā)光（ECL）信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。在這個(gè)平臺(tái)上，免疫測(cè)試格式類似于用于藥物定量和target sample measurements的典型ELISA格式，但預(yù)計(jì)靈敏度會(huì)因使用化學(xué)發(fā)光而增加。MSD平臺(tái)似乎主要在檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生和收集上，相對(duì)于ELISA有顯著改善：MSD采用SULFO-TAG（三聯(lián)吡啶釕）是一種發(fā)光底物，其分子量約為1000Da（大約是HRP的1/40），因此空間位阻小，易于標(biāo)記抗體，且不易妨礙其與待測(cè)物或其它抗體的結(jié)合。SULFO-TAG在陽極表面失去電子，發(fā)生氧化，在三丙胺陽離子自由基的催化及三角形脈沖電壓激發(fā)下，可產(chǎn)生高效、穩(wěn)定、連續(xù)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，使得檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)并穩(wěn)定（見圖1）。
圖1. MSD的電化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)
MSD的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)在生物分析行業(yè)廣受歡迎。它保持了ELISA格式的優(yōu)點(diǎn)，如方法開發(fā)的靈活性，另外在其它領(lǐng)域也非常出色，如較小的樣品體積要求（測(cè)定體積為25–30 ml），更高的靈敏度（低-中pg/ml）和寬泛的動(dòng)態(tài)范圍（4-5個(gè)數(shù)量級(jí)）。當(dāng)以均相的測(cè)試格式運(yùn)行時(shí)，此平臺(tái)可能受到鉤效應(yīng)（hook effect）的影響。鉤效應(yīng)起源于不合適的抗體-抗原濃度比例，但是可以減輕甚至消除的。此外，試劑和微孔板容易有批次間的變化，因此，強(qiáng)烈建議在批次之間進(jìn)行交叉比較。
MSD微孔板的孔底為石墨底，捕獲抗體包被載量可提升10-50倍，檢測(cè)范圍比ELISA擴(kuò)展了10-100倍，定量動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)5-6個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度可提升10-1000倍（fg/ml-pg/ml級(jí)別）。根據(jù)對(duì)血清免疫學(xué)中的“帶現(xiàn)象”的理解，可推測(cè)：包被抗體載量可以根據(jù)檢測(cè)靈敏度的需要進(jìn)行調(diào)整，以避免鉤效應(yīng)（hook effect）。分析運(yùn)行時(shí)間接近約3-4小時(shí)，但考慮到該平臺(tái)提供的其它優(yōu)勢(shì)，測(cè)試時(shí)間可被視為一個(gè)合理的折中。該平臺(tái)允許同時(shí)運(yùn)行多個(gè)96孔板，因此在分析數(shù)百個(gè)樣品時(shí)，測(cè)試一個(gè)或多個(gè)96孔板也只需要基本相同的時(shí)間，這一點(diǎn)可能非常有利。此平臺(tái)不是自動(dòng)化的，因?yàn)樗枰治鋈藛T參與每個(gè)步驟。此外，該平臺(tái)還提供與實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS）的集成和US FDA 21 CFR part 11的合規(guī)性，允許分析方法結(jié)果容易地轉(zhuǎn)移到GLP的環(huán)境中。
Gyrolab平臺(tái)
Gyrolab是一個(gè)非96微孔板的免疫測(cè)試平臺(tái)，具有液體處理功能（liquid handling capability），使用小體積的樣本和試劑在光盤（CD）上實(shí)施免疫測(cè)定。該測(cè)試格式使用biotinylated捕獲試劑和標(biāo)記有fluorophore的檢測(cè)試劑，在納升體積的使用親和力微珠填料的捕獲柱（nanoliter volume affinity capture column）上進(jìn)行測(cè)試。利用CD的微觀結(jié)構(gòu)確定樣品和試劑的體積，并通過旋轉(zhuǎn)CD將樣本加到捕獲柱上。在每個(gè)CD上，有96（在1000nlCD上）-112（在20或200nl CD上）個(gè)微觀結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生96-112個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（1小時(shí)/CD運(yùn)行時(shí)間）。在Gyrolab工作站上，樣品處理完全自動(dòng)化，液體處理臂將樣品和試劑從微孔板轉(zhuǎn)移到CD，并通過激光/檢測(cè)器測(cè)定每個(gè)捕獲柱的熒光信號(hào)。基礎(chǔ)的Gyrolab xPlore™ 允許無人值守地一次分析1張CD，而Gyrolab xPand™允許分析多達(dá)5張CD（即480-560個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)）。在大多數(shù)情況下，動(dòng)態(tài)范圍為3-4個(gè)數(shù)量級(jí)。該平臺(tái)的靈敏度可與MSD的ECL平臺(tái)（低-中pg/ml）相媲美。
Gyrolab是一個(gè)自動(dòng)化的微流體系統(tǒng)（microfluidic system），且其離心操作能夠高效地處理微量體積，因此大多數(shù)重復(fù)(duplicate）分析只需要小于5ml的樣本體積，就可以從同一微孔板重新分析未使用的樣品。該平臺(tái)使用包被了捕獲抗體的微珠來捕獲待測(cè)物，與下面討論的Luminex和Simoa平臺(tái)在捕獲待測(cè)物的原理上，即在更大的固相表面積上有更多的捕獲抗體（與ELISA相比），似乎有異曲同工之妙，總體效果是提升了捕獲待測(cè)物的效率，提升了靈敏度。Gyrolab的一個(gè)出色特點(diǎn)是，可以選擇不同的CD來調(diào)整定量的動(dòng)態(tài)范圍，以滿足對(duì)低或高濃度樣本的分析。該分析技術(shù)平臺(tái)對(duì)于大分子的常規(guī)臨床前PK/PD分析無疑是非常有效的。此平臺(tái)在縮短檢測(cè)時(shí)間方面非常有效，無需人工移液和參與分析的每一步驟。這使得該平臺(tái)對(duì)開發(fā)方法和分析樣本都極具吸引力。此外，該平臺(tái)還提供實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)集成和FDA 21 CFR part 11合規(guī)性，能夠?qū)⒎治龇椒ㄝp松地轉(zhuǎn)移到GLP環(huán)境中去。
Gyros的一個(gè)可能缺點(diǎn)是，如果以基于微孔板格式開發(fā)了分析方法檢測(cè)，則相同的試劑在轉(zhuǎn)移到Gyros時(shí)可能會(huì)性能欠佳，并且可能需要顯著地優(yōu)化才能獲得最佳性能。這是因?yàn)镚yros的孵育時(shí)間極短，需要高結(jié)合效率的捕獲試劑，而基于微孔板的檢測(cè)則不需要這種試劑，因?yàn)檩^長(zhǎng)的孵育時(shí)間抵消了該需求。因此，如果使用Gyros，則需要在同一平臺(tái)對(duì)試劑進(jìn)行篩選，然后測(cè)試其分析性能，并開發(fā)完整的分析方法。
BIAcore平臺(tái)
基于BIAcore平臺(tái)的藥物分析，依賴于待測(cè)物與固定在傳感器芯片（sensor chip surface）表面的待測(cè)物特異的試劑的相互作用。BIAcore實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)該結(jié)合相互作用，并讀出以相對(duì)響應(yīng)單元（relative response units，RU）為單位的響應(yīng)，該響應(yīng)與Surface Plasmon Resonance（SPR）角度的變化相關(guān)，并且由傳感器芯片表面的液體薄膜的折射率變化所決定。折射率的變化與芯片表面結(jié)合的質(zhì)量成正比。這種實(shí)時(shí)的無標(biāo)記技術(shù)與典型的免疫測(cè)定法有很大的不同，免疫測(cè)定法需要多個(gè)孵育和洗滌步驟，以及用于信號(hào)讀出的標(biāo)記檢測(cè)抗體（labeled detection antibody）。對(duì)于臨床前藥物分析，可以將抗藥物特異性抗體固定在芯片表面實(shí)施通用化檢測(cè)，當(dāng)樣本流經(jīng)分析隔室（cell）時(shí)，該抗體將結(jié)合樣本中所含有的mAb藥物。其它方式，如在芯片上固定待測(cè)物，也可用于特定的定量分析。對(duì)于此平臺(tái)，在驗(yàn)證期間必須經(jīng)過10個(gè)周期的殘留（carry-over）測(cè)試，并且還應(yīng)確定最大信號(hào)值（相對(duì)于背景值）的信號(hào)噪聲比（signal-to-noise ratio），以評(píng)估樣本分析期間的方法運(yùn)行性能。此外，還必須評(píng)估在執(zhí)行大批量樣本分析的較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的芯片穩(wěn)定性（分析方法是特定于所使用的芯片類型）。由于該平臺(tái)通常運(yùn)行一夜或更長(zhǎng)時(shí)間，故樣本和試劑的穩(wěn)定性必須比典型的免疫測(cè)試方法具有更長(zhǎng)的短期穩(wěn)定性（超過24小時(shí)），而且在Biacore T200上，樣本的總通量（overall sample throughput）較低。此外，單個(gè)分析運(yùn)行需要包含校準(zhǔn)曲線后和運(yùn)行序列中間隔的QC樣本。通常，這對(duì)應(yīng)于一個(gè)微孔板的校準(zhǔn)品（calibration standards，Cs）和樣本。
可以對(duì)BIAcore實(shí)施IQ/OQ/PQ驗(yàn)證，以滿足符合21 CFR Part 11的要求。使BIAcore儀器達(dá)到GLP合規(guī)的狀態(tài)不是一個(gè)簡(jiǎn)單的過程，需要投入大量時(shí)間來處理數(shù)據(jù)傳輸（data transfer）和合適的校準(zhǔn)（隨時(shí)間推移的）等問題。
該測(cè)試平臺(tái)更多地用于LBA關(guān)鍵試劑的篩選和表征。LBA關(guān)鍵試劑一般定義為：對(duì)待測(cè)物（analyte）特異性的LBA分析試劑，如抗體、多肽、蛋白質(zhì)、耦合物（標(biāo)記），作為試劑的藥物和ADA試劑（陽性和陰性對(duì)照品）。
多通道（multiplexing）分析技術(shù)
Multiplexing測(cè)試方法可以節(jié)省時(shí)間和寶貴的樣品。但是，存在一個(gè)局限：即它們經(jīng)過嚴(yán)格優(yōu)化，只能在指定范圍和基質(zhì)中使用。不同的待測(cè)物對(duì)不同的基質(zhì)和稀釋的反應(yīng)不同，因此，對(duì)于某個(gè)待測(cè)物，優(yōu)化參數(shù)的偏差可能需要重新優(yōu)化整個(gè)multiplexing檢測(cè)方法。在臨床前生物分析中，需要探索了解多種藥物、多個(gè)藥物變異體、多種藥物的組合和多種生物標(biāo)志物。因此，檢測(cè)的靈活性是非常關(guān)鍵的，對(duì)此multiplexing可能幫助意義不是很大。
在樣本體積十分有限的特殊情況下，可以探索multiplexing。允許自主開發(fā)multiplexing方法的平臺(tái)包括：Luminex的xMAP技術(shù)，使用獨(dú)特的dyed beads，并取決于所使用的儀器（MAGPIX、LUMINEX 200或FLEXMAP 3D），可以分析50-500待測(cè)物；Quanterix SR-X，使用6個(gè)獨(dú)特的磁珠，可以multiplexing多達(dá)6個(gè)待測(cè)物；Quanterix SP-X可以multiplexing到10個(gè)待測(cè)物，使用其基于平面陣列的空間分離的化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)。其中，MSD允許從黃金標(biāo)準(zhǔn)的singleplex平臺(tái)直接轉(zhuǎn)換到U-PLEX平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)；Quanterix的SR-X和SP-X平臺(tái)在multiplexing時(shí)能夠提供超高靈敏度。
Luminex平臺(tái)
常用的Luminex®100/200™系統(tǒng)是基于流式細(xì)胞學(xué)（flow cytometry）原理的靈活程度很高的分析儀。該系統(tǒng)使用很小的樣本體積，在單個(gè)微孔板的孔/井中multiplex（同時(shí)測(cè)定）多達(dá)100個(gè)待測(cè)物。該平臺(tái)可以操作許多檢測(cè)格式，包括核酸測(cè)試方法（nucleic acid assays）、受體-配體測(cè)試方法（receptor-ligand assays）、免疫測(cè)試方法（immunoassays）和酶測(cè)試方法（enzymatic assays），并提供快速且經(jīng)濟(jì)高效的生物測(cè)試結(jié)果。
該系統(tǒng)是xMAP® 3個(gè)核心檢測(cè)技術(shù)的組合。第1個(gè)是xMAP微球，這是一個(gè)熒光染色，微米大小的聚苯乙烯微球系列，既作為標(biāo)識(shí)符，又充當(dāng)建立測(cè)試方法的固體表面。第2個(gè)是基于流式細(xì)胞學(xué)的儀器（flow cytometry-based instrument），Luminex 100/200分析儀集成了關(guān)鍵的xMAP檢測(cè)組件，如激光、光學(xué)器件、流體技術(shù)和高速數(shù)字信號(hào)處理器。第3個(gè)組件是xPONENT®軟件，它專門設(shè)計(jì)為基于方案（protocol-based）的數(shù)據(jù)采集方式，具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)回歸分析的能力。
Luminex利用特定染料的珠子（beads），該珠子包被有特定的抗待測(cè)物抗體。添加待測(cè)物孵育后，再添加熒光標(biāo)記的抗體，以檢測(cè)和定量待測(cè)物。此項(xiàng)技術(shù)使用供應(yīng)商預(yù)先生產(chǎn)的試劑盒，主要用于PD檢測(cè)，即生物標(biāo)志物的定量分析，并且采用多通路檢測(cè)（multiplexing）的方式。商業(yè)化的試劑盒數(shù)量巨大，據(jù)稱達(dá)1,300余種。一個(gè)樣本可以用于測(cè)定多個(gè)待測(cè)物，據(jù)稱最多可達(dá)500個(gè)，并且可以對(duì)每種待測(cè)物設(shè)置接受標(biāo)準(zhǔn)。不足之處是：不同待測(cè)物珠子（analyte beads）有交互干擾（cross-talk）的傾向，而且測(cè)試方法對(duì)光敏感，因此必須采取特殊的預(yù)防措施。
超高靈敏的定量分析技術(shù)
對(duì)于某些藥物和樣本基質(zhì)，可能需要具有fg/ml-低pg/ml的超高靈敏度的定量分析方法。相關(guān)狀況包括定量低豐度的生物標(biāo)志物，對(duì)強(qiáng)效藥物分子的PK分析和定量極易受到基質(zhì)效應(yīng)影響的待測(cè)物，顯然，大幅度稀釋樣本會(huì)提升對(duì)測(cè)定平臺(tái)靈敏度和定量動(dòng)態(tài)范圍的要求。
目前，允許自主開發(fā)方法的超高靈敏度的定量分析平臺(tái)包括來自Quanterix，基于Simoa™的數(shù)字化ELISA，來自Singulex的使用單分子計(jì)數(shù)（single molecule counting）的Erenna™，以及來自Chimera Biotec GmbH的基于免疫PCR（immuno-PCR）的Imperacer。
之前已經(jīng)發(fā)表的文章詳細(xì)評(píng)估了這3種超高靈敏度的分析技術(shù)，以及其它不太流行的分析技術(shù)。這3種技術(shù)都是需要供應(yīng)商提供檢測(cè)方法的分析儀器，但都允許用戶自主開發(fā)檢測(cè)方法。當(dāng)擁有實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）儀器（thermal cycler fitted with a fluorimeter）時(shí)，還可以獨(dú)立于供應(yīng)商提供的試劑或儀器開發(fā)Immuno-PCR方法。在使用這些技術(shù)時(shí)，需要特別注意一些非常規(guī)情況，包括Simoa™ 的磁珠偶合，DNA與檢測(cè)試劑的偶合，以及無污染地操作immuno-PCR。
基于單分子陣列（Simoa™）的數(shù)字化ELISA
來自Quanterix公司的Simoa™數(shù)字化ELISA是一個(gè)很有前途的平臺(tái)，它可以使蛋白質(zhì)定量達(dá)到fg/ml。該技術(shù)采用基于微觀順磁珠（microscopic paramagnetic bead）的免疫測(cè)試方法，并結(jié)合獨(dú)特的信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。數(shù)字化ELISA分2個(gè)階段實(shí)施。在捕獲抗原的第1階段，涂有捕獲試劑的微觀磁珠與樣品混合，然后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體（biotinlabeled detection antibody）和鏈球菌素-β-半乳糖酶（streptavidin–b-galactosidase）。然后，這些珠子被加載到光盤上，光盤上裝有一系列體積為飛升（femtoliter）大小的微井陣列。每個(gè)微井的直徑為4.5mm，能夠容納直徑為2.7mm的珠子數(shù)目只能為1或者為0。被硅膠墊片密封的微井含有熒光底物，其用于信號(hào)生成和放大（圖2）。Simoa™ 技術(shù)在定量分析的第二階段采用了獨(dú)特的信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)。微井（50飛升）中濃度相對(duì)較高的發(fā)出熒光的產(chǎn)物（陽性事件）和白光散射（white light scattering）測(cè)定的總珠子負(fù)載可以由標(biāo)準(zhǔn)的CCD攝像機(jī)輕松地檢測(cè)到和記錄。通過改進(jìn)幾個(gè)檢測(cè)步驟，Simoa™ 實(shí)現(xiàn)了超高靈敏度。
圖2. 在飛升體積（femtoliter）的井陣列中裝載，密封和成像單個(gè)順磁珠
因?yàn)樵?00mL的反應(yīng)體積中有約200,000個(gè)磁珠，而每個(gè)磁珠捕獲約80,000個(gè)抗體分子，抗體-待測(cè)蛋白的比值和平衡允許高效地在給定的示例中，>70%捕獲待測(cè)物。由于溶液中有這么多的磁珠，而且可以在溶液中運(yùn)動(dòng)，所以捕獲效率進(jìn)一步提高，因?yàn)槊總€(gè)目標(biāo)蛋白在不到1分鐘時(shí)間內(nèi)就會(huì)遇到磁珠。這與傳統(tǒng)的LBA方法中，固定在一個(gè)表面的捕獲抗體與待測(cè)物的緩慢結(jié)合完全相反。另外，優(yōu)化了的biotin-labeled detection antibody與streptavidin–b-galactosidase之間的比值，可減少檢測(cè)背景并最大化特定信號(hào)的采集。與Simoa™檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，相關(guān)熒光信號(hào)可以通過熒光底物（fluorogenic substrate）的酶消化（enzymatic digestion），而進(jìn)一步放大。
Simoa™ 檢測(cè)系統(tǒng)能夠檢測(cè)到單個(gè)結(jié)合事件（a single binding event），該事件可以在低濃度下以數(shù)字方式獲得（靈敏度增高，數(shù)字化ELISA），或在高濃度模式下以模擬的方式獲得（擴(kuò)展了的定量動(dòng)態(tài)范圍）。熒光用于檢測(cè)酶活性，并能夠測(cè)定每個(gè)磁珠上酶的平均值。與下面描述的Erenna®平臺(tái)一樣，結(jié)合數(shù)字式和模擬式的讀數(shù)功能，可以實(shí)現(xiàn)非常寬廣的定量動(dòng)態(tài)范圍。由于最終信號(hào)采集是在平面陣列上完成標(biāo)準(zhǔn)成像，因此與使用 Erenna®等流體系統(tǒng)的數(shù)值讀出相比，數(shù)據(jù)采集更快。
盡管Erenna® 和Simoa™ 平臺(tái)具有數(shù)字讀出和寬廣的定量動(dòng)態(tài)范圍等共同點(diǎn)，但Simoa™ 平臺(tái)是一個(gè)完全自動(dòng)化的系統(tǒng)，該儀器可以實(shí)施樣品稀釋（高達(dá)1:10稀釋），混合，洗滌，孵化和數(shù)據(jù)采集步驟。Simoa™ 能夠同時(shí)測(cè)定多達(dá)10種不同的待測(cè)物（multiplexing）。這是通過對(duì)單個(gè)捕獲抗體使用不同的dye linkers來實(shí)現(xiàn)的。之后，對(duì)陣列進(jìn)行多個(gè)波長(zhǎng)的熒光成像，以識(shí)別擁有不同dye linkers的亞組，并確定是否存在enzyme reporter標(biāo)記。與Singulex和Quanterix一樣，有許多試劑盒可供選擇。也可以“定制”開發(fā)，或“自主開發(fā)”分析方法。
憑借較高的靈敏度、multiplexing和自動(dòng)化功能，該平臺(tái)看起來非常理想。Simoa™平臺(tái)與LIMS系統(tǒng)兼容，其軟件滿足監(jiān)管級(jí)別的生物分析據(jù)FDA 21 CFR part 11的合規(guī)性要求。筆者認(rèn)為該平臺(tái)因其超高靈敏度（可以使用微量樣本體積）和自動(dòng)化操作，在相當(dāng)?shù)某潭壬峡梢蕴娲鶪yrolab平臺(tái)，用于臨床前PK樣本分析。
Singulex Erenna®平臺(tái)
Erenna®免疫測(cè)試系統(tǒng)利用兩步的過程實(shí)現(xiàn)超高靈敏度定量分析（ultrasensitive assays）。最初，使用biotinylated capture試劑和熒光標(biāo)記檢測(cè)試劑，在96孔板中實(shí)施基于珠子（beads）的夾心式測(cè)試格式。從珠子上洗脫的被捕獲待測(cè)物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)384孔的讀取板（reading plate），然后將該讀取板放置到檢測(cè)儀器上。然后樣本一個(gè)接一個(gè)地通過毛細(xì)管進(jìn)入flow cell，并在其中實(shí)施激光誘導(dǎo)的單分子檢測(cè)分析。該平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)是寬廣的定量動(dòng)態(tài)范圍，其通過獨(dú)特的軟件曲線擬合算法實(shí)現(xiàn)。該算法利用了多次讀數(shù)，提升了靈敏度。
與其它測(cè)試平臺(tái)相比，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，但一些線下的自動(dòng)化設(shè)備可用于洗滌和轉(zhuǎn)移步驟。該平臺(tái)通常用于PD檢測(cè)，但也可用于PK定量分析。對(duì)供應(yīng)商生產(chǎn)和供應(yīng)的試劑盒，其穩(wěn)定性必須由最終用戶評(píng)估，因?yàn)樵噭┑姆€(wěn)定性通常是未知的。此外，可以購買通用試劑，以開發(fā)內(nèi)部的檢測(cè)試劑，而且，基于微孔板的格式也能兼容使用96或384孔板的平臺(tái)。供應(yīng)商建議對(duì)校準(zhǔn)品（Cs）進(jìn)行3次復(fù)測(cè)（triplicate），以便在低濃度下進(jìn)行精確分析?？梢酝ㄟ^IQ/OQ程序，與內(nèi)部PQ相結(jié)合，驗(yàn)證Erenna®平臺(tái)。如果將Erenna®與LIMS結(jié)合，以實(shí)施監(jiān)管級(jí)生物分析，則一個(gè)選擇是使用讀出的三個(gè)信號(hào)之一進(jìn)行濃度分析。但是，動(dòng)態(tài)范圍和靈敏度可能會(huì)受到影響，具體取決于選擇哪個(gè)讀出的信號(hào)。
Immuno-PCR (Polymerase Chain Reaction)
Immuno-PCR（Chimera）是一種擴(kuò)增免疫測(cè)試技術(shù)（signal amplification immunoassay）。它涉及DNA標(biāo)記的檢測(cè)抗體的擴(kuò)增，從而提高靈敏度。與ELISA中使用的抗體-酶偶合物（antibody–enzyme conjugates）不同，IPCR中的關(guān)鍵試劑是抗體-DNA偶合物（antibody–DNA conjugates），其中一個(gè)DNA標(biāo)記（marker）與檢測(cè)抗體相偶合。然后，將DNA polymerase加入到反應(yīng)主混合物之中，就可以放大檢測(cè)信號(hào)，并通過定量PCR（qPCR）而定量測(cè)定DNA-marker的濃度，從而定量分析analyte–antibody immunocomplex。因此，該技術(shù)主要改進(jìn)了檢測(cè)信號(hào)的放大方法。但是，如果檢測(cè)抗體與血清或血漿中的成分發(fā)生交叉反應(yīng)，該平臺(tái)可能容易受到強(qiáng)大基質(zhì)效應(yīng)的影響。因此，在方法驗(yàn)證期間必須評(píng)估信噪比，并用于確定樣本分析期間方法的性能。
該平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)包括寬廣的定量動(dòng)態(tài)范圍和提升了的靈敏度，這對(duì)PD分析是很有益的。與 Erenna®平臺(tái)一樣，檢測(cè)試劑高度依賴于供應(yīng)商，對(duì)于大批量樣本分析來說，成本可能很高。如同MSD、Erenna®和其它基于珠子的平臺(tái)一樣，應(yīng)特別注意標(biāo)記試劑和微孔板批次的變化。由于該平臺(tái)依賴于PCR技術(shù)，因此在處理樣本、試劑和移液器槍頭時(shí)必須小心謹(jǐn)慎，以避免污染。此外，數(shù)據(jù)分析可能也會(huì)較為麻煩（cumbersome）。
7. 特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊, 官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。 參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
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