?此前，“袁來(lái)如此”專欄根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，對(duì)PK定量方法的設(shè)計(jì)作初步介紹（袁來(lái)如此 | 大分子生物分析概論（十四_上）：LBA定量分析雙特異性生物藥的挑戰(zhàn)）。本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點(diǎn)就相關(guān)案例分析、復(fù)雜藥物分子的未來(lái)生物分析技術(shù)以及前景等方面進(jìn)行探討。
“袁來(lái)如此”專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號(hào)打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥藥物研究中心資深科學(xué)顧問(wèn)袁智博士原創(chuàng)。
案例分析（Case studies）
以下案例研究是為了說(shuō)明對(duì)于雙特異性分子而言，生物分析的獨(dú)特考慮，其適用于在藥物開(kāi)發(fā)的不同階段設(shè)計(jì)和實(shí)施定量生物分析和PK評(píng)估。
案例分析1：在非臨床研究中定量總和完整雙特異性藥物并評(píng)估ADA對(duì)PK的影響。
化合物X是一種基于支架的針對(duì)兩種細(xì)胞因子的雙特異性抗體。初步數(shù)據(jù)表明，這種特殊的支架產(chǎn)品平臺(tái)可以在非臨床物種中高頻率地誘導(dǎo)免疫原性。為了更好地解釋ADAs存在時(shí)的毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)，生物分析小組決定開(kāi)發(fā)兩種不同的PK方法來(lái)測(cè)定動(dòng)物血清中的總藥物和完整藥物的濃度。總PK方法是使用兩種抗體對(duì)支架的框架進(jìn)行分析。完整的PK方法是使用一種靶向細(xì)胞因子作為捕獲試劑，另一種作為檢測(cè)試劑?？梢杂^察到，使用兩種PK方法分析相同的樣品產(chǎn)生的濃度與時(shí)間關(guān)系幾乎完全等同，除了在較晚的時(shí)間點(diǎn)之外，藥物濃度非常低的時(shí)候，即完整藥物濃度略低于總藥物濃度的時(shí)候。
在這些時(shí)間點(diǎn)觀察到的低濃度差異只發(fā)生在少數(shù)受試者上。因此，ADA和生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）被認(rèn)為是最可能的根本原因。需進(jìn)行一項(xiàng)研究以確定這種差異的根本原因，如生物轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的不穩(wěn)定性，靶標(biāo)干擾（target interference）和ADA干擾。為了驗(yàn)證這種雙特異性分子的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，例如，蛋白質(zhì)水解是否揭示了影響穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)缺陷，故開(kāi)發(fā)了兩種配體結(jié)合質(zhì)譜(ligand-binding mass spectrometry，LBMS)方法，使用抗人Fc免疫親和捕獲和靶目標(biāo)捕獲，然后進(jìn)行分層次的質(zhì)譜分析。采用與ESI-MS相結(jié)合的納米級(jí)液相色譜法對(duì)非多種代謝產(chǎn)物進(jìn)行了更高分辨率的分離和鑒定。
數(shù)據(jù)顯示，生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果為陰性。ADA分析表明雙特異性分子比其母體藥物的ADA出現(xiàn)頻率更高。盡管隨后通過(guò)免疫原性表征，證實(shí)大多數(shù)ADAs并非中和性ADAs，但發(fā)現(xiàn)ADAs有助于快速地清除完整藥物。這些數(shù)據(jù)也可以解釋為當(dāng)藥物濃度足夠低時(shí)，內(nèi)源性細(xì)胞因子占據(jù)了特定的捕獲/檢測(cè)位點(diǎn)，即存在靶標(biāo)干擾。結(jié)果表明，該藥物在體內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。PK數(shù)據(jù)差異與完整藥物的不穩(wěn)定性無(wú)關(guān)，而更可能是由于ADAs高水平導(dǎo)致清除藥物的速度更快。
案例分析2：一個(gè)F(ab’)2在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化為兩個(gè)活性F(ab)單體的PK分析。
本案例研究涉及一個(gè)雙特異性F(ab’)2，由一個(gè)anti-VEGF arm和一個(gè)anti-Ang2 arm組成，用于玻璃體內(nèi)注射（intravitreal administration）治療視網(wǎng)膜變性疾病，如濕性老年性黃斑變性和糖尿病性黃斑水腫。據(jù)報(bào)道，針對(duì)F(ab’)2抗體鉸鏈區(qū)的，先前存在的內(nèi)源性抗體(PEA)存在于很大比例的人群中。在未接受藥物的食蟹猴和人血清樣本中，都證實(shí)了這一點(diǎn)。移除這些預(yù)先存在的內(nèi)源性抗體的鉸鏈表位（hinge epitopes）使得該分子中只有單個(gè)二硫鍵將兩個(gè)fab結(jié)合在一起。
因此，注射入玻璃體（其含有g(shù)lutathione作為抗氧化產(chǎn)品的一部分，以保證晶狀體的完整性）后，藥物分子生物轉(zhuǎn)化為individual Fabs，相關(guān)清除率(t1/2 <1天)，通常比兔玻璃體的Fab (t1/2 約3天)或F(ab’)2 (t1/2 約3天)的清除率要大(未發(fā)表的觀察結(jié)果)。
備注：一般情況下，t1/2與清除率的關(guān)系如下，即半衰期還取決于藥物分布體積；如果假設(shè)分布體積恒定，則t1/2與清除率之間的關(guān)系是確定成反比的：
因此，完整的F(ab’)2和individual Fab碎片均存在于眼腔(玻璃體和水相之中)和系統(tǒng)循環(huán)之中。正如所預(yù)料的，嚙齒類動(dòng)物脈絡(luò)膜新生血管模型（rodent choroidal neovascularization models）顯示，individual Fabs保留了生物活性。為了全面地描述活性藥物暴露量的特征，有必要定量這3種藥物形式。因此，開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了3種單獨(dú)的PK定量方法。此前有學(xué)者曾經(jīng)考慮過(guò)使用一種總PK定量方法來(lái)測(cè)定所有這3種形式。但是，該分子是一個(gè)新穎結(jié)構(gòu)，故有必要闡明其生物轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)，這對(duì)于描述該分子體內(nèi)的行為是很重要的。
定量完整待測(cè)物的ELISA方法使用固定的（immobilized）重組蛋白Ang2捕獲待測(cè)物，然后加入biotin-VEGF，最后加入streptavidin-HRP，是一個(gè)sequential sandwich格式。外加待測(cè)物的回收率實(shí)驗(yàn)證明這種測(cè)試格式僅能夠特異性地檢測(cè)F(ab’)2，但檢測(cè)不到兩種Fab分子中的任何一個(gè)。定量?jī)蓚€(gè)Fab分子的方法都采納類似的基本格式：使用各自的靶標(biāo)-Ang2或靶標(biāo)-VEGF，從樣本中捕獲Fabs。然后加入biotin-sheep antihuman IgG的重鏈和輕鏈(H&L)，最后，加入streptavidin-HRP進(jìn)行檢測(cè)。
值得注意的是，采用測(cè)定Fab的格式，也可以檢測(cè)到完整分子。盡管使用Fabs作為標(biāo)準(zhǔn)品（standards）和對(duì)照品（controls），在分析Fab時(shí)，也定量了完整F(ab’)2。此外，使用F(ab’)2和任何一個(gè)Fab的混合物，可以通過(guò)從完整分子（高特異性）的定量結(jié)果中減去Fab結(jié)果來(lái)定量另一個(gè)Fab。已經(jīng)驗(yàn)證了所有這些分析方法，并用于兔血清樣本的非臨床研究，也認(rèn)證了這些方法可用于食蟹猴的血清和水/玻璃體/視網(wǎng)膜的萃取物中藥物的定量。血清定量分析的另一個(gè)挑戰(zhàn)是幾個(gè)ng/ml甚至更低的藥物濃度，這也是玻璃體腔生物藥給藥的一致特點(diǎn)：給藥量很小(通常是<1 mg/eye)；藥物在到達(dá)系統(tǒng)循環(huán)時(shí)，經(jīng)歷了高倍數(shù)的稀釋。
案例分析3：在非臨床研究中監(jiān)測(cè)體內(nèi)雙特異性藥物生物轉(zhuǎn)化的總和活性（total and active）藥物的定量。
一個(gè)針對(duì)腫瘤適應(yīng)癥的雙特異性單克隆抗體靶向兩個(gè)細(xì)胞表面的抗原，其藥理作用取決于單克隆抗體的兩個(gè)結(jié)合臂（both binding arms）的完整。然而，在體外生物物理表征過(guò)程中，在其中一個(gè)結(jié)合臂中發(fā)現(xiàn)了翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)的問(wèn)題。但這種PTM，不能在不顯著損害生物活性的情況下，通過(guò)蛋白質(zhì)工程而排除，因?yàn)樵诓环€(wěn)定的氨基酸上的點(diǎn)突變（point mutation）會(huì)完全破壞單抗與靶標(biāo)的結(jié)合。此外，僅具有第二個(gè)結(jié)合臂功能的藥物變異體的累積，可能會(huì)屏蔽活性藥物結(jié)合第二個(gè)靶點(diǎn)，并可能在多次給藥后誘發(fā)毒性反應(yīng)。
對(duì)該單抗體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的特征進(jìn)行研究是勢(shì)在必行的，如轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)和程度，這可以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該單抗提供指導(dǎo)。隨后，使用與分子的Fc部分特異性結(jié)合的測(cè)試試劑開(kāi)發(fā)了一個(gè)橋接格式的總藥物PK定量方法，輔之以一種活性藥物PK定量方法：即使用靶標(biāo)蛋白作為PTM-liable functional domain的捕獲試劑，使用抗人Fc試劑作為檢測(cè)試劑。利用野生型和擁有點(diǎn)突變的藥物的混合比例，活性PK方法，在總藥物存在的情況下，能夠區(qū)分和準(zhǔn)確測(cè)定活性藥物的百分比。之后，評(píng)估了該藥物分子在食蟹猴上的PK特性。使用了總和活性PK定量方法來(lái)測(cè)定研究樣本中總和活性藥物的濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，體內(nèi)樣品中的藥物出現(xiàn)了PTM，并且活性藥物濃度百分比隨時(shí)間而降低。基于建模和仿真，可以在臨床研究中減少劑量間隔來(lái)減輕活性藥物濃度的降低。非臨床研究結(jié)果有助于決定使用活性PK定量方法作為支持臨床研究的主要方法。而在FIH研究中，總PK定量方法可用于進(jìn)一步描述無(wú)活性藥物變異體（inactive drug variants）潛在的累積及其對(duì)PK/PD和毒性的影響。
復(fù)雜藥物分子的未來(lái)生物分析技術(shù)
如表1中所總結(jié)的，一般需要多種PK定量方法和ADA方法評(píng)估ADC和雙特異性抗體的基礎(chǔ)藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性。分析方法數(shù)量的增加給樣本的收集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、分析和分析方法的生命周期管理帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)。在某些情況下，由于樣本數(shù)量有限，根本不可能進(jìn)行多次分析。對(duì)于增加的功能域和潛在的生物轉(zhuǎn)化，僅僅增加分析方法的數(shù)量以滿足生物分析需求似乎是一個(gè)直接的解決方案，但“兩點(diǎn)式two-point”結(jié)合方法（如夾心式LBA）并不適合評(píng)估具有多域（>3）構(gòu)造的分子“完整性intactness”。盡管免疫捕獲（IC-）-LC-MS/MS方法在理論上可以識(shí)別來(lái)自多個(gè)功能域的特征肽，但有關(guān)“完整性”和功能的信息仍然缺失。因此，隨著復(fù)雜藥物模式（complex drug modalities）的生物轉(zhuǎn)化越來(lái)越受到的關(guān)注，定量LBA方法和（IC-）LC-MS/MS方法往往無(wú)法對(duì)潛在的生物轉(zhuǎn)化提供相關(guān)信息。正如CovX-Body和基于框架（scaffold-based）的雙特異性抗體的案例所表明的那樣，PK行為的意外不一致觸發(fā)了潛在生物轉(zhuǎn)化的嫌疑，進(jìn)而就需要新的分析方法來(lái)進(jìn)一步研究。
表1.ADC和雙特異性抗體的PK定量方法（SCR，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍；ECL，電化學(xué)發(fā)光；N.A.，不適用）
備注：表格中參考文獻(xiàn)的標(biāo)注不適用。
因此，使用multiplexed PK/ADA方法以測(cè)定完整藥物、各種變構(gòu)體（variants）和相關(guān)的ADA是非常需要的，同時(shí)，也對(duì)潛在的生物轉(zhuǎn)化提供相關(guān)信息。Multiplexed檢測(cè)方法已在聯(lián)合療法中有早期應(yīng)用，但尚未看到對(duì)復(fù)雜藥物模式“biotransformation ready”的multiplexed測(cè)試方法，用以幫助評(píng)估復(fù)雜藥物的完整性，表征各種生物轉(zhuǎn)化，并測(cè)試對(duì)藥物/藥物變構(gòu)體各部分的免疫反應(yīng)。下文將簡(jiǎn)單介紹對(duì)復(fù)雜藥物模式有希望的兩項(xiàng)生物分析技術(shù)：HR-MS定量分析完整蛋白質(zhì)和毛細(xì)管Western Blot定量分析。
HR-MS 定量分析完整蛋白質(zhì)
與針對(duì)完整藥物分子中某個(gè)選定區(qū)域的LBA和LC-MS/MS技術(shù)相比，完整蛋白質(zhì)的定量分析旨在將一個(gè)復(fù)雜的藥物分子作為一個(gè)整體來(lái)研究，這能夠揭示重要的高層次結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)信息。完整蛋白的LC-MS分析通常用作對(duì)生物轉(zhuǎn)化研究的定性分析。Murphy等人使用IC-LC Q-ToF MS，在CovX-Body雙特異性抗體上發(fā)現(xiàn)并鑒別了蛋白酶剪切掉的含有8個(gè)氨基酸的肽段。He等人利用高分辨率的QTOF-MS與IC-LC相結(jié)合，成功地在小鼠血漿中，鑒別了若干不同DARs的ADC和生物轉(zhuǎn)化了的變異體（biotransformed variants，由于增加/刪除了hexose, glutathione, cysteine以及l(fā)inker-drug）。近年來(lái)，HR-MS在靈敏度和質(zhì)量分辨率方面的提高，逐漸使其在定量生物分析中得以有更廣泛的應(yīng)用。
Jian等人建立了IC-LC-QTOF-MS的工作流程，用于小鼠血漿中人類mAbs的絕對(duì)定量。定量的下限（LLOQ）為1000ng/mL（20 ?L血漿樣品），并可降至250ng/mL，如果使用200?L樣品。在優(yōu)化其數(shù)據(jù)處理策略后，LLOQ降至50ng/mL。使用所述工作流程，Jian等人隨后展示了GLP1-Fc融合蛋白的定量；同時(shí)，在對(duì)小鼠的研究過(guò)程中，識(shí)別了該藥物的兩種主要蛋白酶降解產(chǎn)物。
Lanshoeft等人驗(yàn)證了基于multiplex IC-LC-HRMS的PK定量方法，并用于非臨床PK研究，該方法同時(shí)定量分析了大鼠血清中兩個(gè)人類IgG1。類似地，Jin等人在大鼠血清中定量了完整的trastuzumab emtansine（一種ADC）及其主要的DAR物種，其定量下限值約為20ng/mL，線性動(dòng)態(tài)范圍為5-100?g/mL。
另一個(gè)有趣的應(yīng)用是最近Zhang等人報(bào)道的，在非變性LC條件下對(duì)native intact mAb進(jìn)行的定量分析，這可能為使用LC-HR-MS技術(shù)以multiplex的方式建立結(jié)合（bound）/未結(jié)合（unbound）PK定量方法以及其它各種功能域PK的定量方法提供了機(jī)會(huì)。
毛細(xì)管Western Blot定量分析方法
毛細(xì)管Western blot，也稱為毛細(xì)管納米免疫測(cè)定（capillary nanoimmunoassay，CNIA），已由制造商Protein Simple(San Jose, CA)商業(yè)化的Simple Western system，是指毛細(xì)管電泳免疫測(cè)定系統(tǒng)，它提供基于蛋白質(zhì)大小和電荷的分離格式。與在分離和檢測(cè)之前進(jìn)行配體結(jié)合的IC-LC-MS技術(shù)不同，Western blot首先分離蛋白質(zhì)，然后使用配體結(jié)合作為檢測(cè)方法。因此，它能夠使用multiplexed immunoassay，同時(shí)檢測(cè)完整的蛋白質(zhì)及其生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，并對(duì)變異的各種功能域進(jìn)行表征。
目前，毛細(xì)管Western Blot定量分析在蛋白質(zhì)藥物的PK研究中應(yīng)用仍然有限。Li等人在小鼠研究中驗(yàn)證了無(wú)濃縮的PK方法，以定量小鼠血漿中的polyhistidine N-和FLAG C-terminally-tagged重組蛋白（約55kDa），其LLOQ為20ng/mL。Anti-FLAG tag抗體在immunoblot步驟中用作初級(jí)抗體。研究發(fā)現(xiàn)，只需以1:100至1:500的比例稀釋樣品，即可消除基質(zhì)中高豐度蛋白的干擾。
此外，Kodani等人使用capillary western blot檢測(cè)到丙型肝炎病毒（HCV）的IgG抗體，表明其在抗藥物抗體（ADA）檢測(cè)方面的潛在應(yīng)用。重組HCV蛋白首先在毛細(xì)管中分離和固定。稀釋的人類血清隨后在毛細(xì)管中孵育，使抗HCV抗體與固定的抗原結(jié)合。這一步驟之后，使用抗人類IgG-HRP抗體再進(jìn)行第二次孵育。在70個(gè)特表征良好的人血清樣本的檢測(cè)中，該方法與另一種市售的抗HCV抗體測(cè)試方法的相關(guān)性良好。
結(jié)論
為了解決雙特異性分子開(kāi)發(fā)過(guò)程中所需的生物分析支持，本文討論了在開(kāi)發(fā)這些藥物分子的PK分析策略時(shí)一些獨(dú)特的考慮。本文提出的策略和方法可以應(yīng)用于雙特異性分子和其它多域大分子藥物，這需要對(duì)特定的藥物分子其作用機(jī)制（MOA）和潛在的靶標(biāo)生物學(xué)，以及評(píng)估PK/PD的所需要的數(shù)據(jù)有全面的了解。
大分子生物分析行業(yè)需要新的定量分析技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)multiplexed PK定量方法，以便定量復(fù)雜模式的藥物及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。用于完整蛋白質(zhì)分析的（IC-）LC-HR-MS和capillary Western blot技術(shù)擁有很大應(yīng)用前景，因其multiplexibility和提供目標(biāo)待測(cè)物的多維信息（如分子量等電點(diǎn)和域功能/domain functionality）的能力。在過(guò)去幾年中， HR-MS和capillary Western blot platforms的定量靈敏度有了顯著改善，盡管這些技術(shù)仍需要進(jìn)一步改善，以獲得更廣泛的接受。當(dāng)前HR-MS系統(tǒng)的一般操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但HR-MS（以及capillary Western blot）的數(shù)據(jù)分析、解釋和驗(yàn)證，從監(jiān)管的角度看，還需要進(jìn)一步明確。
從理想的和雄心勃勃的角度思考，最好將PK/PD/免疫原性/生物轉(zhuǎn)化的生物分析整合到一個(gè)分析測(cè)試方法之中，以減少藥物開(kāi)發(fā)所需的資源，并促進(jìn)在同一組患者樣本中全面闡明藥物的PK/PD行為。設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)這樣的定量分析的方法，對(duì)每一種生物藥結(jié)構(gòu)都是獨(dú)特的，需要一種徹底的“適合其用途”的方法及其確認(rèn)（confirmation）。為雙（多）特異性分子開(kāi)發(fā)可靠、穩(wěn)健和可重現(xiàn)的PK分析方法是非常具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)槎喾N因素會(huì)影響準(zhǔn)確（accurate）而有意義（meaningful）的濃度測(cè)定值。未來(lái)生物分析行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)指導(dǎo)定量分析這些高度復(fù)雜的生物（蛋白）藥的最佳做法的討論和意見(jiàn)，將會(huì)極具價(jià)值。
未來(lái)前景
隨著生物分析方法的特異性、選擇性和靈敏度的不斷提高，更準(zhǔn)確（accurate）和更精密（precise）的測(cè)定雙特異性抗體濃度和評(píng)估其在生物樣品中的免疫原性將成為可能。預(yù)計(jì)雙特異性和多特異性生物藥的數(shù)量和種類將繼續(xù)擴(kuò)大，這將促進(jìn)新的生物分析方法的開(kāi)發(fā)，以適應(yīng)這些分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和MOAs。
當(dāng)然，目前的方法將被用于新的蛋白藥物的定量。盡管LBA方法是目前生物分析方法的首要選擇，并且在可以預(yù)見(jiàn)的未來(lái)仍將如此，LC-MS/MS方法，由于其與生俱來(lái)的multiplexed的定量分析能力，可能會(huì)得到更加廣泛地應(yīng)用，以支持雙特異性生物藥的PK評(píng)估。LC-MS/MS比LBA分析具有更少的分析變異性（variability）和關(guān)鍵試劑的可及性（availability）問(wèn)題。預(yù)期分析實(shí)驗(yàn)室的自動(dòng)化將擴(kuò)展到生物分析的所有階段，以減少人工錯(cuò)誤和提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。
特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來(lái)自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開(kāi)渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
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