限于篇幅，本文只探討3個(gè)議題，對(duì)其它相關(guān)問(wèn)題感興趣的讀者請(qǐng)閱文末的參考文獻(xiàn)。
將ELISA方法轉(zhuǎn)移到其它分析平臺(tái)
在開發(fā)臨床前LBA分析方法時(shí)，ELISA可能是首選的方法，因其簡(jiǎn)單性，低成本，并且不需要專門的儀器設(shè)備。但是，如果ELISA方法不能滿足靈敏度和穩(wěn)健性要求時(shí)，特別是對(duì)GLP毒理/毒代研究而言，需要在一個(gè)CRO實(shí)施該研究時(shí)，往往需要將一個(gè)ELISA方法轉(zhuǎn)移到MSD或者GYROS平臺(tái)至上實(shí)施。
MSD
從ELISA轉(zhuǎn)移到MSD平臺(tái)相對(duì)簡(jiǎn)單；當(dāng)使用特定抗體對(duì)的ELISA方法無(wú)法到達(dá)所需要的靈敏度時(shí)，會(huì)經(jīng)常實(shí)施這樣的轉(zhuǎn)移來(lái)減少基質(zhì)效應(yīng)，提高靈敏度或增加定量動(dòng)態(tài)范圍。然而，就像其它方法轉(zhuǎn)移一樣，試劑的差異和不同的修飾（modifications），如ruthenium或生物素標(biāo)記，可能會(huì)影響方法的效能。因此，雖然可以在MSD上重新使用已有的抗體對(duì)和測(cè)試格式，但將需要調(diào)整校準(zhǔn)品（Cs）和QCs的濃度，并充分驗(yàn)證新的方法。
Gyrolab
在理想的情況下，需要小體積樣本或半自動(dòng)化的分析方法應(yīng)當(dāng)直接在Gyrolab平臺(tái)上開發(fā)。如果一對(duì)抗體（antibody pair）可用于相同的捕獲-檢測(cè)組合，則將ELISA方法直接成功地轉(zhuǎn)移到Gyrolab上的可能性更大； 盡管可能需要重新優(yōu)化，以提高靈敏度和/或擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍。 重新優(yōu)化包括測(cè)試抗體對(duì)的組合；調(diào)整抗體濃度，以最大化靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍；測(cè)試選擇性，以盡量減少M(fèi)RD；以及重建動(dòng)態(tài)范圍和QC水平。在轉(zhuǎn)移方法到Gyrolab平臺(tái)的時(shí)候，修改試劑，如使用生物素（biotin）或熒光標(biāo)記，也會(huì)影響測(cè)定性能。在任何情況下，都需要在此平臺(tái)實(shí)施完全的方法驗(yàn)證。
BIAcore
BIAcore和ELISA之間的差異太大，不能直接轉(zhuǎn)移分析方法；因此，需要進(jìn)行方法的再開發(fā)，和全面的方法驗(yàn)證。 由于BIAcore是一個(gè)基于流體的系統(tǒng)，因此不宜直接與基于固相（例如，微孔板）的免疫測(cè)試方法進(jìn)行比較。需要進(jìn)一步開發(fā)BIAcore方法，例如芯片的固定（immobilization）和再生條件，用于固定和再生緩沖液的試劑，試劑的穩(wěn)定性，確定標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量控制樣品，以及配體結(jié)合測(cè)試（LBA）方法的其他方面。
Luminex
如果以Luminex格式定量單個(gè)待測(cè)物，則從ELISA格式的方法轉(zhuǎn)移在測(cè)試方法的布局方面非常簡(jiǎn)單，盡管需要制備，評(píng)估和驗(yàn)證新的試劑（例如，dye-coated beads，熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體）。有時(shí)，在洗滌步驟中需要額外的微孔板（真空或磁珠板）。如果需要將多個(gè)ELISA方法組合并轉(zhuǎn)移到一個(gè)Luminex方法（由于其multiplexing功能），則需要進(jìn)行額外的研究；并且，優(yōu)化方法參數(shù)可能需要更多的方法開發(fā)時(shí)間。總體而言，必須全面驗(yàn)證單通路和multiplex格式的Luminex方法；ELISA方法中使用的條件有助于確定開發(fā)Luminex方法的格式和抗體對(duì)。
分析大數(shù)量樣本和儀器故障
MSD
對(duì)于在MSD上的樣本分析，校準(zhǔn)品（Cs）和QCs的位置通常與ELISA的位置相同。另一方面，值得注意的是：對(duì)微孔板一次只讀取四個(gè)孔的數(shù)據(jù)，而且在施加電壓后只能讀取一次。因此，如果發(fā)生儀器故障，可能無(wú)法測(cè)定整個(gè)校準(zhǔn)曲線；或者取決于微孔板設(shè)置（plate set-up），可能缺少一組QC的一部分，這通常發(fā)生在水平設(shè)置（horizontal set-up）中。對(duì)于垂直設(shè)置（vertical set-up），更有可能獲得校準(zhǔn)品和第1組QC，而不是第二組QC。在這兩種情況下，將需要重新讀取整個(gè)微孔板。如果儀器發(fā)生故障，而且讀數(shù)緩沖液已添加到微孔板中，則可能需要重新分析（re-assay）樣品，因?yàn)闄z測(cè)信號(hào)會(huì)隨時(shí)間顯著地減少。
Gyrolab
通常，一個(gè)分析運(yùn)行被定義為一個(gè)CD，在每個(gè)CD上都放置有校準(zhǔn)品和 QCs。如果放置在不同CDs上的QCs的精密度和偏差符合接受標(biāo)準(zhǔn)，則在無(wú)人值守的運(yùn)行中處理的最多五張CDs的系列可以定義為一個(gè)單次運(yùn)行。 這需要測(cè)試和評(píng)估一個(gè)給定的格式是否滿足上述接受標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檫@取決于能否快速捕獲待測(cè)物的和試劑的穩(wěn)定性。
需要將接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于每個(gè)CD，這意味著具有失敗的QCs和/或失敗校準(zhǔn)曲線的CDs會(huì)被拒絕，而來(lái)自同一個(gè)多個(gè)CD運(yùn)行中的其它CDs可以通過(guò)。如果含多個(gè)CD的運(yùn)行僅有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且此曲線不符合接受條件，則此多個(gè)CD的運(yùn)行的所有數(shù)據(jù)將被拒絕。由于多個(gè)CD運(yùn)行的風(fēng)險(xiǎn)，故應(yīng)在方法驗(yàn)證時(shí)，需要對(duì)樣品分析時(shí)的校準(zhǔn)曲線和QCs設(shè)置進(jìn)行評(píng)估。在任何情況下，每個(gè)CD都必須含有QCs。
如果在運(yùn)行過(guò)程中懷疑針頭故障，例如，觀察到結(jié)構(gòu)之間（inter-structure）高的CVs，則需要使用供應(yīng)商提供的儀器日常維護(hù)測(cè)試方法，測(cè)試液體處理裝置的性能。故可以識(shí)別不符合接受標(biāo)準(zhǔn)的樣本，校準(zhǔn)品或QCs所使用的針頭，并可以在未來(lái)的運(yùn)行中重新分析。液體處理裝置有10個(gè)針頭，分析數(shù)據(jù)指明了用于轉(zhuǎn)移某一樣本的針頭。
一些較新的LBA分析平臺(tái)，包括Gyrolab，提供比ELISA更寬泛的動(dòng)態(tài)范圍。盡管如此，仍建議使用相同數(shù)量的校準(zhǔn)品和 QCs（在每個(gè)CD/微孔板的每個(gè)QC級(jí)別重復(fù)兩次）進(jìn)行驗(yàn)證（LLOQ，LQC，MQC，HQC，ULOQ）和樣品分析（LQC，MQC，HQC），如同對(duì)ELISA方法建議的那樣。
Luminex
常見的做法是設(shè)置板中（in-plate）校準(zhǔn)品，并重復(fù)（duplicate）分析校準(zhǔn)品和樣本。校準(zhǔn)品的范圍通常比 ELISA的范圍更寬，以適應(yīng)各種待測(cè)物濃度，并確定每個(gè)待測(cè)物的校準(zhǔn)曲線和QCs響應(yīng)。值得指出，對(duì)于另一種待測(cè)物，校準(zhǔn)曲線上的錨定點(diǎn)可能不一樣。
如果儀器在運(yùn)行中失?。矗a(chǎn)生一個(gè)部分運(yùn)行partial run），只要相關(guān)校準(zhǔn)品和QCs成功完成且可以接受，則仍然可以使用已分析樣本的數(shù)據(jù)。與某些順序測(cè)定平臺(tái)（sequential platforms）相比，這不太令人擔(dān)心；而在那些順序平臺(tái)上，只有有限的QCs位于相對(duì)較大量的樣本之間；這樣的話，就可能沒(méi)有足夠的QCs來(lái)判斷許多樣本分析的結(jié)果是否有效。
BIAcore
該平臺(tái)與RIA一樣，系列式地（in series）分析樣品，并使用微孔板加載樣本。因此，有兩種方法可以運(yùn)行 BIAcore 樣本分析。與 ELISA一樣，按96孔，設(shè)置校準(zhǔn)品和QCs；或者將兩個(gè)板（或更多）可以作為一個(gè)整體來(lái)運(yùn)行：在開始時(shí)，分析校準(zhǔn)品，并且在整個(gè)樣本分析中穿插幾組QCs。產(chǎn)生部分運(yùn)行結(jié)果的原因，可能是由于儀器故障；也可能是由于未知原因?qū)е翾C失敗。應(yīng)根據(jù)發(fā)生的情況和時(shí)間處理儀器故障。在由于未知原因?qū)е翾C失敗的情況下，當(dāng)兩組已接受的QCs之間的所有樣本都需要重新分析時(shí)，可以使用bracket approach，如表3所示。
表3. Biacore樣本分析設(shè)置
總體而言，如果40%或更多個(gè)QC失敗，則必須重新分析，在可接受的最后一組QC之后的，所有樣本。只有在運(yùn)行開始時(shí)的一組QC都通過(guò)了的情況下，才能接受第一組樣本的分析結(jié)果。如果QC的成功和失敗是零星的（sporadic），則整個(gè)樣本分析運(yùn)行失敗，必須進(jìn)行原因調(diào)查。RIA使用類似的方法，系列式地分析一組試管。
實(shí)施樣本分析的最佳實(shí)踐
1.在方法開發(fā)的過(guò)程中，最好消除殘留（carry-over），而不是在樣本分析中加以計(jì)算校正。
2.對(duì)于每個(gè)平臺(tái)，應(yīng)使用短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)來(lái)確定每次運(yùn)行的持續(xù)時(shí)間，以確保樣本穩(wěn)定性。
3.一個(gè)分析運(yùn)行不限于96個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（校準(zhǔn)品加樣本）；例如，對(duì)于基于不同硬件支持，如CD和/或系列運(yùn)行[run in series]，如RIA，BIAcore，Erenna®，和 Gyrolab的平臺(tái)。
4.在分析運(yùn)行開始時(shí)，首先分析標(biāo)（校）準(zhǔn)曲線；之后，以合理的頻率在運(yùn)行中間隔地分析QCs，以驗(yàn)證該分析平臺(tái)上的結(jié)果。取決于如何定義一個(gè)分析運(yùn)行，可以在每個(gè)固體支持（solid support）上設(shè)置校準(zhǔn)品，也可以設(shè)置在一個(gè)微孔板/CD上；之后是QCs間隔的一系列樣本。無(wú)論一個(gè)分析運(yùn)行是如何定義的，應(yīng)當(dāng)有規(guī)律地多次分析QCs，以確認(rèn)運(yùn)行內(nèi)的精密度。
5.只要在方法驗(yàn)證期間確定的%CV在可接受的范圍內(nèi)，例如，小于或等于目前能夠接受的15%（對(duì)小分子而言），則可以進(jìn)行單個(gè)樣品分析，并采用最嚴(yán)格的接受標(biāo)準(zhǔn)。如果運(yùn)行超過(guò)多個(gè)固體支持，則%CV標(biāo)準(zhǔn)指的是重復(fù)（duplicate）運(yùn)行的QCs，和包括多個(gè)固體支持的運(yùn)行內(nèi)精密度。
6.對(duì)于方法轉(zhuǎn)移，在更改分析方法的平臺(tái)或格式時(shí)，大多數(shù)平臺(tái)需要重新驗(yàn)證；即便是部分驗(yàn)證也可能錯(cuò)過(guò)對(duì)一些關(guān)鍵參數(shù)的評(píng)估。因此，建議對(duì)樣本分析方法進(jìn)行完整的重新驗(yàn)證。
7.Multiplexing：建議盡可能在待測(cè)物的混合物中，驗(yàn)證每一個(gè)待測(cè)物。在樣本分析期間，如果一個(gè)待測(cè)物的分析失敗，則應(yīng)重新分析所有樣本，并屏蔽先前合格待測(cè)物的分析結(jié)果。
總結(jié)與前瞻
總之，大多數(shù)藥物發(fā)現(xiàn)階段的PK/PD免疫分析可以在MSD或Gyrolab平臺(tái)上進(jìn)行。Gyrolab還具有運(yùn)行時(shí)間短，樣本體積小和自動(dòng)化，等附加優(yōu)勢(shì)，因此對(duì)臨床前生物分析極具吸引力。無(wú)論分析平臺(tái)如何，本文強(qiáng)烈建議，在最終所需分析方法的同一平臺(tái)上，篩選試劑和評(píng)估方法的性能。在另一方面，超高靈敏度和multiplexing平臺(tái)是特殊的應(yīng)用平臺(tái)，通常不能對(duì)試劑進(jìn)行高通量篩選。因此，可以首先在ELISA，MSD，Gyrolab或BIAcore（SPR技術(shù)）平臺(tái)上對(duì)試劑進(jìn)行篩選，然后在相關(guān)特殊平臺(tái)上優(yōu)化并最終建立相關(guān)方法。Simoa™平臺(tái)因其超高靈敏度（可以使用微量樣本體積）和自動(dòng)化操作，在相當(dāng)?shù)某潭壬峡梢蕴娲鶪yrolab平臺(tái)，用于臨床前PK樣本分析。
針對(duì)可溶性靶標(biāo)的新藥項(xiàng)目，需要在方法開發(fā)的開始，就利用BIAcore平臺(tái)使用的SPR技術(shù)來(lái)克服耐受性（tolerance）問(wèn)題。選擇分析平臺(tái)時(shí)，應(yīng)當(dāng)牢記最終目標(biāo)。雖然獲得完美的方法參數(shù)是最理想的，但就檢測(cè)方法的局限性和項(xiàng)目需求而言，需要切合實(shí)際；因此，需要有愿意在使用的樣本體積或分析運(yùn)行的時(shí)間，等參數(shù)上，做出妥協(xié)，以滿足整體需求。與項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)良好的溝通有助于確定相關(guān)工作的優(yōu)先級(jí)別，滿足對(duì)分析方法的需求并滿足相關(guān)時(shí)間表。當(dāng)項(xiàng)目的目標(biāo)預(yù)期發(fā)生變化時(shí)，需要對(duì)分析方法的格式保持足夠的靈活性，以便在不同的分析平臺(tái)之間，輕松地轉(zhuǎn)移分析方法。
每個(gè)平臺(tái)在檢測(cè)試劑，如Sulfo-tag、horseradish peroxidase（HRP或其他酶）方面，差異最大。因此，試劑的生物素化（biotinylation），當(dāng)與各自對(duì)應(yīng)的鏈球菌蛋白標(biāo)記的試劑（streptavidin-tagged reagents）一起使用時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)分析方法在這些平臺(tái)之間的無(wú)縫轉(zhuǎn)移。在需要將捕獲試劑生物素化的平臺(tái)（Gyrolab）上，這些生物素化的試劑可以作為捕獲（capture）使用。無(wú)論是分析針對(duì)可溶性靶標(biāo)的藥物的游離的，還是結(jié)合的百分比，或是分析復(fù)雜分子的分子完整性，都應(yīng)當(dāng)利用免疫測(cè)試方法的多功能性（versatility），并相應(yīng)地考慮合適的分析平臺(tái)。雖然免疫分析領(lǐng)域正在迅速發(fā)展，但LC-MS等正交性生物分析平臺(tái)也在平行地發(fā)展，有時(shí)可以作為免疫分析方法的補(bǔ)充。因此，充分了解正交分析平臺(tái)，并及時(shí)向這些平臺(tái)的團(tuán)隊(duì)提示研究方向，將有助于項(xiàng)目的成功。后續(xù)文章將介紹相關(guān)進(jìn)展，敬請(qǐng)關(guān)注。
特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來(lái)自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。 參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
參 考 文 獻(xiàn)
1. Eangoor, P. (2020). "A guided approach to preclinical bioanalysis of proteins using immunoassays for pharmacokinetic and pharmacodynamic assessments." Bioanalysis 12(16): 1105-1110.
2. Fischer SK, et al. Emerging technologies to increase ligand binding assay sensitivity. AAPS J. 17(1), 93–101 (2015).
3. Dudal S, et al. Assay formats: recommendation for best practices and harmonization from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16, 194–205 (2014).
4. Patel SR, et al. Microsampling for quantitative bioanalysis, an industry update: output from an AAPS/EBF survey. Bioanalysis 11(7), 619–628 (2019).
5. Roman J, et al. Application of miniaturized immunoassays to discovery pharmacokinetic bioanalysis. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 63(3), 227–235 (2011).
6. Leary BA, et al. Bioanalytical platform comparison using a generic human IgG PK assay format. J. Immunol. Methods 397(1–2), 28–36 (2013).
7. Duo J, et al. Surface plasmon resonance as a tool for ligand-binding assay reagent characterization in bioanalysis of biotherapeutics. Bioanalysis 10(8), 559–576 (2018).
8. Spengler M, et al. Highly sensitive ligand-binding assays in pre-clinical and clinical applications: immuno-PCR and other emerging techniques. Analyst 140(18), 6175–6194 (2015).
9. Lind K, Kubista M. Development and evaluation of three real-time immuno-PCR assemblages for quantification of PSA. J. Immunol. Methods 304(1–2), 107–116 (2005).
10. Attallah C, et al. Design and validation of an immuno-PCR assay for IFN-α2b quantification in human plasma. Bioanalysis 11(23), 2175–2188 (2019).
11. Woodbury N, et al. Application of multiplexed pharmacokinetic immunoassay to quantify in vivo drug forms and coadministered biologics. Bioanalysis 11(24), 2251–2268 (2019).
12. Stevenson LF, Purushothama S. Parallelism: considerations for the development, validation and implementation of PK and biomarker ligand-binding assays. Bioanalysis 6(2), 185–198 (2014).
13. Lee JW, et al. Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement. Pharm. Res. 23(2), 312–328 (2006).
14. Stevenson L, et al. Large molecule specific assay operation: recommendation for best practices and harmonization from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16(1), 83–88 (2014).
15. Desilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm. Res. 20(11), 1885–1900 (2003).
16. Lee JW, et al. Bioanalytical approaches to quantify ‘total’ and ‘free’ therapeutic antibodies and their targets: technical challenges and PK/PD applications over the course of drug development. AAPS J. 13(1), 99–110 (2011).
17. Pearson JT, Rock DA. Bioanalytical approaches to assess the proteolytic stability of therapeutic fusion proteins. Bioanalysis 7(23), 3035–3051 (2015).
18. Vasicek LA, et al. Direct quantitation of therapeutic antibodies for pharmacokinetic studies using immuno-purification and intact mass analysis. Bioanalysis 11(3), 203–213 (2019).
