本期《袁來(lái)如此》為系列文章《大分子生物分析概論》的第八篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，初步介紹LBA中的質(zhì)量控制樣品（QC，quality control）制備、認(rèn)證（qualification）和批次一致性維護(hù)的相關(guān)概念和實(shí)踐。
由于內(nèi)容篇幅較長(zhǎng)，本文將采取上下篇形式進(jìn)行推送，敬請(qǐng)垂注！《袁來(lái)如此》專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號(hào)打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。
配體結(jié)合測(cè)試方法（LBA）的性能，在研究前方法驗(yàn)證和研究中樣本分析期間，體現(xiàn)在QC的效能。需要采用嚴(yán)格和既定的方法合理地管理QC樣品的生命周期，內(nèi)容包括制備、質(zhì)量控制以及QC性能的監(jiān)控。
雖然在監(jiān)管機(jī)構(gòu)的指南和有關(guān)LBA的文獻(xiàn)中有關(guān)于QC樣品的制備和認(rèn)證接受標(biāo)準(zhǔn)（acceptance criteria）的相關(guān)討論，但此類文獻(xiàn)只是較為初步地討論了這些參數(shù)，且只涉及方法開(kāi)發(fā)和研究前驗(yàn)證的階段，并沒(méi)有對(duì)QC生命周期管理的問(wèn)題和對(duì)這一過(guò)程至關(guān)重要的因素做出討論和解答。關(guān)于新QC批次的生產(chǎn)和認(rèn)證（用來(lái)保持QC批次間的一致性和防止測(cè)試結(jié)果偏移）的許多問(wèn)題仍然沒(méi)有得到解決。此外，大多數(shù)生物分析實(shí)驗(yàn)室缺乏健全的方法或統(tǒng)計(jì)工具來(lái)監(jiān)測(cè)QC趨勢(shì)，而這種監(jiān)測(cè)對(duì)于QC性能以及生命周期的管理是至關(guān)重要的。
本文旨在填補(bǔ)這一方面的空白，為QC樣品生命周期的管理及其組成部分提供指導(dǎo)、建議和最佳實(shí)踐。這其中包括：QC的制備、認(rèn)證和其性能趨勢(shì)的監(jiān)控。幫助生物分析實(shí)驗(yàn)室，在其標(biāo)準(zhǔn)操作程序 （SOPs）中，定義QC的認(rèn)證，并制定批次間一致性的指導(dǎo)原則。應(yīng)當(dāng)在已驗(yàn)證的分析方法或每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的樣本分析計(jì)劃中，對(duì)研究和分析方法特異性的具體要求（assay- and study-specific requirements）和規(guī)范加以考慮和做出詳細(xì)說(shuō)明。本文主要側(cè)重于用于LBA定量和定性分析中的QC，如藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和抗藥物抗體（ADA）的測(cè)試。其他類別的測(cè)試方法不在討論的范疇。
標(biāo)準(zhǔn)品（Reference standard）、混合樣本基質(zhì)、QC的組成成分、設(shè)備和生產(chǎn)策略都是制備用于LBA的QC樣品的關(guān)鍵因素。以下各節(jié)將根據(jù)這些因素展開(kāi)討論。
QC樣品應(yīng)使用與研究樣本基質(zhì)相似，且盡可能與其接近的基質(zhì)來(lái)制備。例如，如果研究樣本是未過(guò)濾、未離心或未經(jīng)活性炭處理的血清，則QC基質(zhì)也應(yīng)是未過(guò)濾、未離心或未經(jīng)活性炭處理的同一物種的血清。應(yīng)使用未稀釋（100%）的基質(zhì)制備QC樣品，以便對(duì)QC樣品與研究樣本采取相同的稀釋步驟[如最低稀釋度（minimum required dilution，MRD）]。
但不排除特殊情況，例如用替代基質(zhì)代替稀有的研究基質(zhì)（通常很難獲得足夠數(shù)量的稀有基質(zhì)包括：腦脊液、關(guān)節(jié)腔滑液或來(lái)自某些物種的眼部基質(zhì)（ocular matrices）等），但這需要適當(dāng)?shù)睦碛?，并且只允許在需要保留基質(zhì)（matrix conservation）的情況下使用。緩解基質(zhì)體量問(wèn)題的推薦方法是在替代基質(zhì)中準(zhǔn)備3個(gè)QC水平中的2個(gè)，而在研究基質(zhì)中制備一個(gè)濃度的QC。如果使用替代基質(zhì)，則需要證明其與研究基質(zhì)具有等效性。最好使用與制備標(biāo)準(zhǔn)品（calibrators）相同批次的基質(zhì)來(lái)制備QC樣品，以增強(qiáng)方法的一致性和重現(xiàn)性。
中間原液（intermediate stock）是用于制備QC樣品的待測(cè)物溶液，可以在下列稀釋劑中制備，如水、緩沖液或有機(jī)介質(zhì)（organic media）。當(dāng)中間原液是水或緩沖液時(shí)，QC的最終成分至少為95%（v/v）的樣本基質(zhì)；當(dāng)使用有機(jī)溶劑（如DMSO或乙酸）制備時(shí)，最終成分至少為99%（v/v）的樣本基質(zhì)。
應(yīng)當(dāng)分別制備QC樣品與標(biāo)準(zhǔn)品，以防止加入待測(cè)物時(shí)的系統(tǒng)性誤差。建議使用不同的中間原液和不同的稀釋步驟來(lái)制備QC樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，還建議在每個(gè)濃度中獨(dú)立加入待測(cè)物，而不是通過(guò)序列稀釋（serial dilutions）高濃度的QC樣品。這一點(diǎn)尤為重要，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品如果是通過(guò)高濃度樣品的序列稀釋制備的，序列稀釋QC樣品和標(biāo)準(zhǔn)品能夠掩蓋稀釋線性度的問(wèn)題，應(yīng)該避免這種操作。
在QC制備時(shí)，PK定量分析中的標(biāo)準(zhǔn)品（reference standard）或ADA檢測(cè)中的陽(yáng)性對(duì)照品（positive antibody control）必須在其有效期內(nèi)。應(yīng)該單獨(dú)建立QC樣品的穩(wěn)定性和有效期（與用于制備的標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)關(guān)），因?yàn)镼C樣品中的待測(cè)物是在基質(zhì)之中，與原液中的標(biāo)準(zhǔn)品是不同的。
可以制備、分裝和儲(chǔ)存將標(biāo)準(zhǔn)品用研究基質(zhì)或適當(dāng)稀釋劑稀釋時(shí)所產(chǎn)生的中間原液，以供未來(lái)制備QC樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。在這種情況下，中間原液的穩(wěn)定性應(yīng)覆蓋其儲(chǔ)存窗口期，即從其制備日期起至使用日期為止。這可以通過(guò)比較下述2種樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)：1. 從凍存的中間原液（frozen intermediate stock）制備的標(biāo)準(zhǔn)品和/或QC樣品；2. 使用初始的標(biāo)準(zhǔn)品原液（original reference standard stock）制備的標(biāo)準(zhǔn)品和/或QC樣品。
正確地選擇用于制備QC樣品的基質(zhì)，對(duì)于保證分析方法的質(zhì)量和防止分析結(jié)果漂移是至關(guān)重要的。這在ADA檢測(cè)中尤其重要，因?yàn)楹细竦幕|(zhì)（QMP），作為陰性對(duì)照（NC），將直接影響微孔板特異性的切點(diǎn)，必須在已驗(yàn)證的定量分析方法中或適當(dāng)?shù)腟OP中，建立并明確規(guī)定適當(dāng)?shù)幕|(zhì)篩選（screening）、選擇（selection）過(guò)程以及接受標(biāo)準(zhǔn)。有關(guān)基質(zhì)質(zhì)量認(rèn)證（qualification）的建議總結(jié)如下。
第一個(gè)合格基質(zhì)的批次認(rèn)證通常是作為分析方法開(kāi)發(fā)的一部分進(jìn)行的，并在方法驗(yàn)證時(shí)進(jìn)行正式的認(rèn)證。
& 認(rèn)證足夠體量的合格基質(zhì)，足以在多個(gè)研究和多個(gè)藥物開(kāi)發(fā)階段一直使用。至少，有足夠體量的合格基質(zhì)可以滿足研究前驗(yàn)證以及一項(xiàng)或多項(xiàng)生物樣本分析研究。
& 合格基質(zhì)的儲(chǔ)存條件與預(yù)期研究樣本的儲(chǔ)存條件一致（如-20℃或-80℃）。
& 制備混合基質(zhì)（matrix pool）的第一步，是通過(guò)比較未添加和添加了待測(cè)物的基質(zhì)樣本所產(chǎn)生的分析信號(hào)，來(lái)篩選單個(gè)基質(zhì)樣本或混合基質(zhì)樣本（多個(gè)、單個(gè)樣本的混合物）。
& 作為背景值，考察未添加待測(cè)物的基質(zhì)樣本的響應(yīng)值。應(yīng)當(dāng)將背景異常高的基質(zhì)樣本剔除，例如，高于PK定量下限（LLOQ）或高于ADA預(yù)估切點(diǎn)的樣本。對(duì)于ADA分析，背景異常低也可能有問(wèn)題。
& 對(duì)于PK定量分析，可根據(jù)分析方法或?qū)嶒?yàn)室SOP中確定的接受標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估添加了待測(cè)物的基質(zhì)樣本。如建議相對(duì)誤差（RE）的接受標(biāo)準(zhǔn)在±20%范圍內(nèi)；建議在LLOQ和低QC(LQC)之間的濃度水平上添加待測(cè)物到單個(gè)基質(zhì)樣本，并且至少在一次分析運(yùn)行中這樣做。
& 對(duì)于ADA分析，必須強(qiáng)調(diào)空白信號(hào)（blank signal，NC）的重要性。當(dāng)沒(méi)有其它批次的基質(zhì)可比較時(shí)，建議在篩查測(cè)試(screen，Tier 1)中評(píng)估單個(gè)基質(zhì)樣本，并比較組內(nèi)各個(gè)樣本的響應(yīng)值，以評(píng)估其原始響應(yīng)值。應(yīng)將所有異常高響應(yīng)值或低響應(yīng)值的單個(gè)基質(zhì)排除在替換混合基質(zhì)（replacement matrix pool）之外。在可能的情況下，還應(yīng)將混合基質(zhì)（matrix pool）與一組疾病狀態(tài)的基質(zhì)樣本進(jìn)行比較，以確定其合用性（suitability）。
& 對(duì)于PK定量分析，混合基質(zhì)的背景的接受標(biāo)準(zhǔn)，可以是比預(yù)估的LLOQ低2-3倍的基質(zhì)響應(yīng)。ADA分析的接受標(biāo)準(zhǔn)，可以是低于預(yù)估的切點(diǎn)或在特定的響應(yīng)范圍內(nèi)。
& 使用與認(rèn)證第一批次相同的分析方法，對(duì)替換批次的基質(zhì)樣本進(jìn)行認(rèn)證。
–確保未外加待測(cè)物的現(xiàn)有的和替換的合格基質(zhì)（QMP）的響應(yīng)值具有可比性。
–對(duì)于PK定量分析，應(yīng)當(dāng)將替換基質(zhì)批次與現(xiàn)有合格批次進(jìn)行比較。至少在一次分析運(yùn)行中，分析添加了待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品的樣本（濃度在LLOQ和LQC之間，至少n=3）。標(biāo)準(zhǔn)品（reference standard）的分析回收率(AR)，在現(xiàn)有和替代批次的基質(zhì)中，都應(yīng)在80至120%的范圍內(nèi)。同時(shí)，使用兩個(gè)基質(zhì)批次制備的樣本所測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品濃度之差不超過(guò)10%。
–為了認(rèn)證ADA分析中的替換合格基質(zhì)（replacement QMP），應(yīng)當(dāng)使用先前建立的微孔板特異的切點(diǎn)因子，對(duì)單個(gè)基質(zhì)樣本進(jìn)行篩查。篩查測(cè)試中是陽(yáng)性的所有單個(gè)樣本都應(yīng)排除在替換合格基質(zhì)之外。另一種方法是直接考察每個(gè)基質(zhì)樣本的信噪比(S/N)，應(yīng)將超過(guò)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的切點(diǎn)因子的基質(zhì)樣本排除在替換合格基質(zhì)之外。
以下推薦的是替換合格基質(zhì)的接受標(biāo)準(zhǔn): 替換基質(zhì)批次的響應(yīng)值，應(yīng)當(dāng)在現(xiàn)有基質(zhì)批次響應(yīng)值的±10%以內(nèi)。如果不是，則應(yīng)當(dāng)評(píng)估一組單個(gè)基質(zhì)樣本，并與兩個(gè)微孔板特異的切點(diǎn)比較，以確定篩查結(jié)果是陽(yáng)性或陰性。其中一個(gè)切點(diǎn)是用現(xiàn)有合格基質(zhì)的陰性對(duì)照計(jì)算的，另一個(gè)切點(diǎn)是用替換合格基質(zhì)制備的陰性對(duì)照計(jì)算的。使用這兩個(gè)切點(diǎn)（現(xiàn)有vs.替換微孔板特異的切點(diǎn)）所得出的篩查結(jié)果（陰性/陽(yáng)性狀態(tài)）應(yīng)當(dāng)相似（comparable），但borderline samples，根據(jù)基質(zhì)響應(yīng)，可能是陽(yáng)性或陰性。
在PK分析中，基質(zhì)的背景響應(yīng)應(yīng)保持在最低狀態(tài)，因?yàn)樗绊懛治鲮`敏度，并可能限制定量的范圍。對(duì)于ADA分析，建議一旦獲得驗(yàn)證數(shù)據(jù)，就應(yīng)盡快確定基質(zhì)響應(yīng)范圍的上限和下限。
& 在非競(jìng)爭(zhēng)性定量（如PK）免疫測(cè)試中，基質(zhì)背景不應(yīng)超過(guò)LLOQ的1/3。
& 在競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析中，背景值至少為最低校準(zhǔn)點(diǎn)數(shù)值的1.11倍。這是基于B/B0（最低校準(zhǔn)點(diǎn)信號(hào)/零校準(zhǔn)點(diǎn)信號(hào)，lowest calibrator signal/zero calibrator）建議的90%（100/90）。
& 在ADA和其他非定量分析中，對(duì)基質(zhì)背景的一般建議是相對(duì)發(fā)光單位（RLUs）≤200和吸光度≤0.200。有些測(cè)試方法的基質(zhì)背景則比上述建議的要高。
& 基質(zhì)背景的下限由儀器響應(yīng)決定，不同儀器和不同實(shí)驗(yàn)室的儀器響應(yīng)可能不同。
& 用于制備QC樣品的設(shè)備，包括移液器，應(yīng)進(jìn)行精密度驗(yàn)證，并應(yīng)在校準(zhǔn)范圍內(nèi)。
& 設(shè)備校準(zhǔn)的過(guò)程和頻率應(yīng)在SOP中規(guī)定明示。
& 在一些實(shí)驗(yàn)室，除了定期校準(zhǔn)之外，還需要在使用移液器制備QC樣品之前進(jìn)行額外的校準(zhǔn)檢查，但在一些實(shí)驗(yàn)室，如果定期校準(zhǔn)仍然有效，則不需要重新進(jìn)行校準(zhǔn)檢查。
此處的一般運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)適用于現(xiàn)有和替換QC批次的認(rèn)證。此處下列術(shù)語(yǔ)：基線批次（baseline QC lots）、遺留QC批次（legacy lots）或QC比較批次（comparator QC lots）可互換使用。
1. QC樣品可與之前認(rèn)證過(guò)的，且有已知穩(wěn)定性的凍存校準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)和認(rèn)證。如果沒(méi)有合格的凍存標(biāo)準(zhǔn)品，則應(yīng)使用重新制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)QC樣品進(jìn)行評(píng)估。在后一種方法中，需要加入之前認(rèn)證過(guò)的一組QC樣品對(duì)新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行認(rèn)證。
2. 認(rèn)證（qualification）是通過(guò)評(píng)估分析內(nèi)和分析間的精密度（inter- and intra-assay precision，對(duì)所有方法）和準(zhǔn)確度(對(duì)定量方法)來(lái)進(jìn)行的。
3. 對(duì)定量和藥代動(dòng)力學(xué)分析方法，QC樣品必須滿足精密度和準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)：變異系數(shù)(coefficient of variation，CV) ≤20%，RE在±20%之內(nèi)；定量下限（LLOQ）和上限（ULOQ）：CV≤25%，RE在±25%之內(nèi)。
1. QC樣品應(yīng)滿足CV≤20%的標(biāo)準(zhǔn)。
2. 現(xiàn)有和替換QC的響應(yīng)值都應(yīng)在其相應(yīng)濃度級(jí)別已建立的響應(yīng)范圍內(nèi)。如果替換的QC批次不在相應(yīng)的信號(hào)范圍內(nèi)，則實(shí)驗(yàn)室必須排除故障并確定其根本原因。ADA陽(yáng)性對(duì)照（PC）和陰性對(duì)照（NC）信號(hào)漂移的潛在原因包括：(a)待測(cè)物添加錯(cuò)誤；(b) 混合基質(zhì)選擇不當(dāng)；(c)信號(hào)范圍設(shè)定不正確。
后續(xù)的故障排除應(yīng)遵循以下順序: 首先準(zhǔn)備一個(gè)新批次的QC樣品，如果重復(fù)制備的QC仍然失敗，則認(rèn)證一個(gè)新批次的合格基質(zhì)（QMP）；然后重新制備陽(yáng)性和陰性對(duì)照，如果新制備的陽(yáng)性和陰性對(duì)照仍然在其信號(hào)范圍之外，則納入研究中測(cè)試運(yùn)行得出的額外數(shù)據(jù)，進(jìn)而重新評(píng)估已建立的信號(hào)范圍。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)足夠的測(cè)試運(yùn)行次數(shù)所得出的數(shù)據(jù)，適當(dāng)?shù)卮_定驗(yàn)證后信號(hào)范圍，以避免將其范圍設(shè)置得過(guò)窄或者不適合長(zhǎng)期使用。
3. 接受標(biāo)準(zhǔn)：高陽(yáng)性對(duì)照（HPC）>低陽(yáng)性對(duì)照（LPC）>切點(diǎn)>陰性對(duì)照。
1. 建議在每次認(rèn)證的測(cè)試運(yùn)行中，至少測(cè)試3組現(xiàn)有和替換QC樣品。在這個(gè)要求上，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)有所不同。
2. 至少三分之二的測(cè)試運(yùn)行應(yīng)滿足上述規(guī)定的接受標(biāo)準(zhǔn)。這些認(rèn)證要求和建議見(jiàn)表I。
3. 現(xiàn)有的和替換的QC樣品必須滿足上述的常規(guī)運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)。
4. 如果替換批次的QC樣品不符合上述接受標(biāo)準(zhǔn)，而現(xiàn)有批次合格時(shí)，則應(yīng)將替換批次廢除，并制備另一批次的QC樣品。當(dāng)一個(gè)濃度水平的替換QC樣本不合格時(shí)，可以重新制備該濃度水平的QC。
5. 如果現(xiàn)有的QC批次在替換批次的認(rèn)證過(guò)程中未能通過(guò)接受標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)重新分析以確認(rèn)相關(guān)結(jié)果。如果現(xiàn)有的批次在重復(fù)分析后仍然不合格，那么它就不能用作比對(duì)品（comparator）。在這種情況下，應(yīng)遵循<現(xiàn)有合格批次不存在時(shí)的認(rèn)證>章節(jié)所描述的程序和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
第一個(gè)批次的QC樣品，也被稱為基線（baseline）或遺留（legacy）批次，通常作為研究前方法驗(yàn)證中的準(zhǔn)確度和精密度（A&P）評(píng)估的一部分進(jìn)行認(rèn)證。對(duì)研究前方法驗(yàn)證中的QC批次進(jìn)行認(rèn)證時(shí)，推薦至少進(jìn)行獨(dú)立運(yùn)行6次，每個(gè)QC濃度至少運(yùn)行3次，至少分2天進(jìn)行，至少2名分析人員參與。且要求至少4/6的QC認(rèn)證運(yùn)行應(yīng)該滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，才滿足對(duì)該批次QC認(rèn)證（見(jiàn)表1）。在可能的情況下，還建議將該QC批次與方法開(kāi)發(fā)時(shí)所用的QC樣品建立橋接聯(lián)系。對(duì)這種橋接性評(píng)價(jià)的接受標(biāo)準(zhǔn)將由各個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室自行制定， 推薦二者之間的誤差為±10%或更低。特定樣品的運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)必須滿足常規(guī)運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)。
i. 通過(guò)與現(xiàn)有合格QC批次比較的認(rèn)證
在研究前的方法驗(yàn)證之外，每次制備替換批次QC樣品時(shí)，通過(guò)與之前認(rèn)證了的（合格）批次的比較，對(duì)替換批次進(jìn)行認(rèn)證。為了可靠地進(jìn)行可比性評(píng)估，必須使用相同的凍存或新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)評(píng)估現(xiàn)有的和替換的QC批次。
一個(gè)替換批次的QC樣品至少要經(jīng)過(guò)2個(gè)獨(dú)立的認(rèn)證運(yùn)行（qualification runs）。QC認(rèn)證運(yùn)行可能在同一天由多個(gè)分析人員（至少2名），或同一分析人員在不同天（至少2天）進(jìn)行。建議在同一認(rèn)證運(yùn)行中，至少要包括3組獨(dú)立的替換批次QC樣品和至少3組現(xiàn)有批次的QC樣品。一組從單獨(dú)凍存和分裝的QC所制備的樣品被定義為一組獨(dú)立的QC樣品（一組有三個(gè)濃度級(jí)別）。在QC認(rèn)證過(guò)程中，不鼓勵(lì)在同一測(cè)試運(yùn)行中使用同一凍存和分裝的QC制備的一組QC。個(gè)別實(shí)驗(yàn)室可以制定不同于此處建議的標(biāo)準(zhǔn)，如根據(jù)其對(duì)所涉及的變異性和風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估，分別進(jìn)行3次獨(dú)立測(cè)試運(yùn)行，而不是2次。
定量LBA方法中，替換QC批次的認(rèn)證，應(yīng)當(dāng)以常規(guī)運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定為基礎(chǔ)，同時(shí)也應(yīng)當(dāng)以其與現(xiàn)有合格QC批次的可比性（comparability）為基礎(chǔ)。例如，可比性標(biāo)準(zhǔn)可包括現(xiàn)有批次和替換批次之間±10%或以下的差異。使用現(xiàn)有和替換QC樣品的測(cè)量濃度，可以用下面的公式確定差異百分比值（%）。
替換批次濃度-現(xiàn)在批次濃度
用于ADA和其他非定量LBA檢測(cè)方法, 現(xiàn)有和替換的QC批次都應(yīng)該滿足ADA和定性分析的常規(guī)運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)。此外，現(xiàn)有和替換PCs和NCs的響應(yīng)都應(yīng)該在各自建立的信號(hào)范圍內(nèi)。
ii. 不存在現(xiàn)有合格（認(rèn)證過(guò)的）QC批次情況下的認(rèn)證
可能存在這樣的情況，即可能不存在遺留的，經(jīng)認(rèn)證合格的QC樣品，因?yàn)檫@些QC樣品已經(jīng)用完或過(guò)期。不存在可比較QC的情況下，建議使用不同的中間原液（intermediate stocks），由不同的分析人員，分別制備兩個(gè)批次的QC樣品。從實(shí)際操作上，可以指定一個(gè)批次，可能是批量較大的，為主要批次（primary lot）；另一批次，可能是小批量的，就作為參照品（comparator），對(duì)主要批次進(jìn)行認(rèn)證。對(duì)主要和次要批次的對(duì)比測(cè)試應(yīng)由2人進(jìn)行，每人使用獨(dú)立制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)試，每人進(jìn)行3次測(cè)試，至少分2天進(jìn)行，總共運(yùn)行6次。至少4/6 (2/3)的QC認(rèn)證運(yùn)行應(yīng)該滿足接受標(biāo)準(zhǔn)。也應(yīng)滿足上述的常規(guī)運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)。兩個(gè)替換批次的QC樣品應(yīng)滿足±10%或更嚴(yán)格的偏差標(biāo)準(zhǔn)，保證二者中任何一個(gè)批次均可接受。表1總結(jié)了這些認(rèn)證要求。
在含有內(nèi)源性待測(cè)物的基質(zhì)中制備的QC的認(rèn)證
在定量PK分析中，當(dāng)基質(zhì)中含有待測(cè)物的內(nèi)源性同源物時(shí)，所測(cè)定的空白基質(zhì)濃度可能是至關(guān)重要的；并應(yīng)該納入考慮。有2種方式：
1.減法：在報(bào)告測(cè)定的QC值之前，從測(cè)定的QC樣品濃度中減去空白基質(zhì)的濃度；2.加法：將測(cè)定的空白基質(zhì)濃度加上QC的外加待測(cè)物濃度，以確定其調(diào)整后的標(biāo)稱值。Marcelletti等人介紹了幾個(gè)案例研究；其中，使用加法和減法，直接比較了加標(biāo)回收率；這些案例研究評(píng)估了具有明顯內(nèi)源性水平的許多生物標(biāo)記物的回收率。根據(jù)這些已發(fā)表的案例研究，減法是首選方法，而不推薦使用加法。建議在每個(gè)認(rèn)證運(yùn)行中至少包含3組空白基質(zhì)樣本，其測(cè)定的平均濃度用于調(diào)整值（adjusted value）的計(jì)算。建議對(duì)含有內(nèi)源性待測(cè)物的QC樣品，在10-20天內(nèi)至少進(jìn)行30次運(yùn)行，至少有2人參與，每個(gè)運(yùn)行使用≥3組QC樣品。此類QC認(rèn)證的運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)與定量PK方法的常規(guī)運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)相同。
未知標(biāo)稱濃度（Nominal Concentration）的QC的認(rèn)證
如果QC原液的標(biāo)稱濃度未知，如未純化的蛋白質(zhì)和一些商業(yè)來(lái)源的對(duì)照原液（commercial control stocks），或者在血液學(xué)檢測(cè)中，當(dāng)crude血清/血漿被用作血液因子的來(lái)源時(shí)，標(biāo)稱濃度必須根據(jù)多位分析人員在不同日期進(jìn)行的多次運(yùn)行中檢測(cè)到的平均值來(lái)確定。
此類測(cè)試的適當(dāng)規(guī)范是特異于測(cè)試方法的，必須作為研究前測(cè)試方法驗(yàn)證的一部分建立起來(lái)。QC樣品的制備方法是將待測(cè)物原液，以特定稀釋倍數(shù)，加入到經(jīng)過(guò)認(rèn)證（合格）的空白混合基質(zhì)或適當(dāng)?shù)南♂寗╠iluent）中。對(duì)于所有成功的運(yùn)行，每個(gè)QC的平均測(cè)定值就應(yīng)設(shè)定為標(biāo)稱值。建議至少正常實(shí)施測(cè)試運(yùn)行30次，由至少2人在10-20天內(nèi)執(zhí)行，以設(shè)定QC樣品的標(biāo)稱濃度。每個(gè)測(cè)試運(yùn)行包含 ≥3 組QC。在最初的測(cè)定之后，日常分析運(yùn)行中QC樣品的接受標(biāo)準(zhǔn)以及將來(lái)替換QC批次的接受標(biāo)準(zhǔn)為已確定的標(biāo)稱值（nominal value）的±20%。任何替換批次的待測(cè)物濃度必須在此確定的范圍內(nèi)。由于來(lái)自血清和血漿的因子的固有的變異性，可能需要，基于最初的20-30次的運(yùn)行數(shù)據(jù)，為每個(gè)QC濃度水平指定一個(gè)臨時(shí)的標(biāo)稱值；然后，在有其它可用數(shù)據(jù)時(shí)，重新評(píng)估這個(gè)標(biāo)稱值的適用性。如果測(cè)試方法的內(nèi)在變異性較大，則可能需要定期地重新評(píng)估和重新建立QC的接受范圍。前述的PK定量方法的常規(guī)運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)也必須得到滿足。
標(biāo)稱濃度與測(cè)定濃度單位不一致的QC的認(rèn)證
酶活性測(cè)試方法是QC標(biāo)稱值和測(cè)定值單位不同的方法之一。在這些分析測(cè)試中，酶類藥物的標(biāo)稱(外加)濃度通常是ng/mL或?g/mL；然而，加標(biāo)QC樣品測(cè)定值的活性單位為nmol/h/mL或nmol/h/?g。這些QC單位上的差異構(gòu)成了獨(dú)特的挑戰(zhàn)，因?yàn)樗荒苡?jì)算準(zhǔn)確度。
在這種情況下，可以通過(guò)建立QC的標(biāo)稱活性值（nominal activity value）來(lái)克服這個(gè)局限性。每個(gè)濃度級(jí)別的標(biāo)稱QC活性值可以，由至少2人，根據(jù)至少30次合格運(yùn)行的平均測(cè)定活性值，在至少10-20天內(nèi)建立。每次運(yùn)行至少應(yīng)包含3組QC樣品。所有合格運(yùn)行的平均活性測(cè)定值，即為QC的標(biāo)稱活性值，并可以使用下面的公式計(jì)算單個(gè)QC樣品的%RE：
其中，標(biāo)稱QC活性值m30，含義是進(jìn)行30次運(yùn)行所測(cè)定活性的平均值。在最初的測(cè)試完成之后，日常運(yùn)行和替換QC批次的接受標(biāo)準(zhǔn)就是QC活性標(biāo)稱值的±20%。表2總結(jié)了上面討論的，有關(guān)特殊類別的QC樣品的注意事項(xiàng)。
表2. 對(duì)特殊類別QC樣品的要求的總結(jié)
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