在臨床前和臨床研究中，LBA是用于定量分析抗體生物藥、抗藥物抗體和可溶性蛋白生物標(biāo)志物濃度的重要方法之一。但由于研究樣本主要由復(fù)雜的生物基質(zhì)組成，這些基質(zhì)可能表現(xiàn)出一定的干擾性，從而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的定量結(jié)果。本文將著重討論在藥物開發(fā)過程中如何緩解或消除對(duì)LBA定量分析方法干擾的策略，重點(diǎn)關(guān)注抗體生物藥的定量分析。
由于篇幅有限，本文將采用上下篇的形式來展開論述，敬請(qǐng)垂注！
抗體生物藥在批準(zhǔn)上市的生物藥中占有很大的比例。
自1986年首次批準(zhǔn)鼠抗體Muronomab-CD3上市，到2013年通過Glyco工程人源化的obinutuzumab上市以來，共36個(gè)抗體藥物獲批用于治療人類疾病。開發(fā)抗體藥物的一個(gè)重要部分是分析藥物的藥（毒）代動(dòng)力學(xué)/（PK/TK），藥效動(dòng)力學(xué)（PD）和免疫原性（immunogenicity）表征。
動(dòng)物研究中的PK和PD數(shù)據(jù)可用于PK/PD建模，并指導(dǎo)人體首次劑量的選擇，隨后可以啟動(dòng)PK/PD迭代建模和仿真（simulation）的過程，從而完善從早期到晚期的臨床開發(fā)過程中的劑量選擇?？煽康腜K和PD數(shù)據(jù)是成功地進(jìn)行 PK/PD 建模和仿真的先決條件，生物藥的免疫原性也能對(duì)其PK產(chǎn)生很大的影響，是臨床安全評(píng)估的重要組成部分。
此外，在臨床研究中準(zhǔn)確評(píng)估適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)志物可以為靶標(biāo)參與度、藥理機(jī)制證明和原理證明以及選擇最有可能對(duì)藥物作出響應(yīng)的患者群體提供有價(jià)值的信息。
免疫測(cè)試方法（Immunoassays）或更廣義地稱為配體結(jié)合式測(cè)試方法（ligand binding assays, LBA）是一種常用的分析方法，用于測(cè)定抗體藥物、抗藥物抗體（ADA）和可溶性蛋白生物標(biāo)志物（soluble protein biomarkers）。這些測(cè)試針對(duì)的生物樣本是復(fù)雜的基質(zhì)，包含各種成分，其可以顯著地影響定量待測(cè)物的準(zhǔn)確性。對(duì)分析方法的干擾（interference）之前在文獻(xiàn)中討論過，但關(guān)注的重點(diǎn)是臨床化驗(yàn)室中所使用的化驗(yàn)方法，藥物開發(fā)過程中使用的許多檢測(cè)方法是定制開發(fā)的，對(duì)其表征也較少。
本文將側(cè)重于用于評(píng)估定量分析抗體生物藥濃度和ADA時(shí)遇到的干擾以及緩解干擾的策略。
關(guān)鍵術(shù)語(yǔ)
干擾：測(cè)定值與實(shí)際值不同的現(xiàn)象。干擾可能來自物質(zhì)（substances）、測(cè)試程序、試劑和樣本的采集/處理。
相關(guān)文獻(xiàn)中之前提出干擾的定義是：樣品中存在的物質(zhì)，其發(fā)揮影響或效應(yīng)改變了對(duì)一個(gè)待測(cè)物的正確的分析結(jié)果；該結(jié)果通常表達(dá)為待測(cè)物的濃度或活性數(shù)值。干擾可以區(qū)分為依賴于待測(cè)物的和不依賴于待測(cè)物的兩類。依賴于待測(cè)物的干擾包括直接影響對(duì)待測(cè)物的檢測(cè)（detection of the analyte）的所有因素。不依賴于待測(cè)物的干擾能夠在沒有待測(cè)物的情況下產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，或直接抑制測(cè)試試劑。干擾導(dǎo)致結(jié)果的不真實(shí)可以是增加的或者減少的。
基質(zhì)干擾：導(dǎo)致測(cè)定的待測(cè)物濃度與其真實(shí)濃度不同的任何基質(zhì)成分，引起基質(zhì)干擾的物質(zhì)分子通常不得而知。
基質(zhì)干擾通常稱為非特異性。一個(gè)測(cè)試方法是被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)（detect）某個(gè)特定的待測(cè)物，基質(zhì)中任何能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)或者抑制待測(cè)物信號(hào)的組成成分都可以定義為非特異性干擾。
然而，在對(duì)測(cè)試方法和待測(cè)物的生物學(xué)進(jìn)行詳細(xì)評(píng)估之后，通常所觀察到的干擾并不令人驚訝，并且是由一個(gè)確定的生物分子引起的。因此，生物分析必須嚴(yán)格地審視現(xiàn)有的文獻(xiàn)以及之前的研究成果和試劑的特異性，以便相應(yīng)地確定該測(cè)試方法的特異性（specificity）。通常，干擾（Interference）和特異性是相關(guān)的， 一個(gè)擁有絕對(duì)特異性的測(cè)試方法不應(yīng)受到任何基質(zhì)干擾的影響。
但是，生物基質(zhì)較為復(fù)雜。即便對(duì)測(cè)試方法的系統(tǒng)和待測(cè)物的生物學(xué)有深度理解，也并不總是足以防止干擾的發(fā)生。與很少只檢測(cè)到單一條帶的western blots方法相似，大多數(shù)免疫測(cè)試方法（immunoassays）的特異性并不總是只針對(duì)一個(gè)待測(cè)物（圖1舉例說明了不同類型的干擾）。此外，干擾物質(zhì)的分子性質(zhì)是未知的，減少干擾最常用的方法是樣本稀釋。這種方法被廣泛地使用，以致于大多數(shù)分析科學(xué)家傾向于稀釋所有的樣本，而不相信未稀釋樣本的檢測(cè)結(jié)果。
一類值得特別注意的干擾物質(zhì)是樣本中的抗體。Heterophilic抗體一般具有廣泛的反應(yīng)性、低親和力、能交聯(lián)（crosslink）捕獲和檢測(cè)抗體，容易導(dǎo)致錯(cuò)誤的高信號(hào)結(jié)果。人抗動(dòng)物抗體被認(rèn)為具有較高的親和力，由于許多測(cè)試試劑含有來自小鼠的單克隆抗體，因此，人抗小鼠抗體是特別相關(guān)的一類干擾物質(zhì)。
當(dāng)今臨床上使用的測(cè)試方法仍然在某種程度上對(duì)heterophilic敏感，臨床醫(yī)生應(yīng)該考慮相關(guān)策略，以應(yīng)對(duì)免疫測(cè)試得出的不正確結(jié)果所造成的潛在損害。類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor），即針對(duì)人類IgG的Fc區(qū)域的人類抗體，具有類似的效果，可以阻斷待測(cè)物與試劑的結(jié)合或交聯(lián)測(cè)試試劑，特別是當(dāng)試劑是人源的時(shí)候（例如，用抗體藥物作為測(cè)試試劑進(jìn)行ADA檢測(cè)）。
干擾也可以來自于待測(cè)物或測(cè)試試劑的變化甚至降解，從而導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)的降低。當(dāng)測(cè)試試劑可以結(jié)合到微孔板的表面或其它測(cè)試平臺(tái)上類似的表面的時(shí)候，會(huì)不真實(shí)地增加測(cè)試信號(hào)。最后，當(dāng)樣本的采集或處理過程引入了不反映所涉及生物體液中待測(cè)物濃度的額外待測(cè)物時(shí)，待測(cè)物本身也就產(chǎn)生干擾（見圖1）。同樣，非常高濃度的待測(cè)物可以通過所謂的鉤狀效應(yīng)抑制測(cè)試信號(hào)。
圖1.免疫測(cè)試中的基質(zhì)干擾；HAMA：人抗鼠抗體; int.：干擾分子; RF：類風(fēng)濕因子
在支持臨床前和臨床研究的LBA方法中，可以在檢測(cè)研究樣本之前評(píng)估大多數(shù)的干擾。這種評(píng)估和減輕干擾的過程是定量分析方法開發(fā)的一個(gè)重要組成部分，通?？梢酝ㄟ^一些簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來揭示干擾的存在。
平行性/線性和加標(biāo)樣品的回收率
通?？梢酝ㄟ^測(cè)試樣品的連續(xù)稀釋來揭示干擾的存在。對(duì)不同程度的樣本稀釋，干擾很可能會(huì)導(dǎo)致所測(cè)定的濃度（dilution-adjusted concentration）的變化或不同。在大多數(shù)測(cè)試中，這種并行性的缺乏通常在較高的稀釋倍數(shù)下會(huì)消失，表明干擾是由一個(gè)基質(zhì)組分引起的。因此，如果在高濃度的情況下出現(xiàn)不平行性,干擾很可能是由于高濃度的干擾性基質(zhì)成分，能夠以高親和力結(jié)合待測(cè)物或測(cè)試試劑的基質(zhì)成分，或標(biāo)準(zhǔn)參考（比）物與內(nèi)源性待測(cè)物之間的差異引起的。
嚴(yán)格地說，后一種情況不是干擾，而是表明標(biāo)準(zhǔn)參考（比）物不適合用于定量?jī)?nèi)源性待測(cè)物。在這種情況下，測(cè)試方法只是準(zhǔn)（半）定量的。當(dāng)一定量的待測(cè)物加入到樣品中時(shí)，不受干擾的分析方法應(yīng)該能夠?qū)尤肓窟M(jìn)行定量（回收率=100% + 誤差），基質(zhì)干擾往往會(huì)導(dǎo)致外加待測(cè)物的回收率降低，即<100%。如果內(nèi)源性待測(cè)物與添加的待測(cè)物的性質(zhì)不同，如重組蛋白vs內(nèi)源性蛋白，回收率本身只能作為干擾的一個(gè)指示。<>
阻斷干擾和特異性的相互作用
如果測(cè)試信號(hào)在添加阻斷試劑（例如阻斷緩沖液/ blocking buffers或heterophile阻斷試劑）后發(fā)生變化，則可能存在因測(cè)試試劑之間的相互作用或固體載體引起的基質(zhì)干擾。阻斷試劑與稀釋研究已被用于篩查干擾的類型，使用特異性試劑阻斷待測(cè)物可能會(huì)揭示非特異性信號(hào)，因?yàn)樘禺愋宰钄嘣噭?yīng)該使得特異性信號(hào)的完全喪失。如果測(cè)試信號(hào)或一部分信號(hào)在使用阻斷試劑后仍然存在，這就意味著存在干擾。
研究結(jié)果評(píng)估
即使經(jīng)過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治龇椒ㄩ_發(fā)，測(cè)試研究樣本時(shí)也會(huì)出現(xiàn)干擾，有時(shí)是因抗體藥物或聯(lián)合用藥導(dǎo)致的基質(zhì)變化所引起的。出現(xiàn)干擾的指示是測(cè)試結(jié)果與給藥后的預(yù)期效果不一致，特別是在研究的過程中，比較個(gè)體的PK，PD和免疫原性數(shù)據(jù)時(shí)。相關(guān)的檢測(cè)結(jié)果不一致也是存在干擾的一個(gè)重要指示，然而關(guān)于研究結(jié)果是否有效的結(jié)論則應(yīng)該謹(jǐn)慎，出乎預(yù)料的結(jié)果很有可能也是有效的。
下一節(jié)將討論在可溶性蛋白生物標(biāo)志物，抗體藥物和ADA測(cè)試中觀察到的干擾。
可溶性蛋白生物標(biāo)記物的定量分析已成為藥物開發(fā)的基石，并為藥物開發(fā)過程中的安全性、有效性、PD和作用機(jī)制的評(píng)估提供重要信息。血液循環(huán)或尿液中的可溶性蛋白質(zhì)樣本很容易獲得，在臨床上作為常規(guī)的診斷性測(cè)試（diagnostic assays）使用，或用于預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物的反應(yīng)。在這個(gè)領(lǐng)域中，診斷測(cè)試中存在干擾是公認(rèn)的，因此完全依賴某一個(gè)測(cè)試結(jié)果可能導(dǎo)致誤診。
一個(gè)明顯的例子是在診斷性人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)（diagnostic human chorionic gonadotropin assay）中，最可能由heterophilic抗體干擾引起的假陽(yáng)性結(jié)果導(dǎo)致了不必要的，包括外科手術(shù)和化療的治療性干預(yù)。用于支持測(cè)試方法開發(fā)的研究的聚焦點(diǎn)（focus）和深度（depth），取決于該方法的預(yù)期目的，因而出現(xiàn)“符合其用途（fit-for-purpose）的方法開發(fā)”這個(gè)術(shù)語(yǔ)。
關(guān)于生物標(biāo)志物的分析方法開發(fā)和驗(yàn)證，通用指南的發(fā)布極大地推進(jìn)了生物標(biāo)志物檢測(cè)的方法開發(fā)和驗(yàn)證的實(shí)踐。本文關(guān)注的焦點(diǎn)在于測(cè)試方法對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾。
樣本采集和處理
從血細(xì)胞中非特異性地釋放待測(cè)物可能發(fā)生在涉及血液基質(zhì)的樣品采集或處理過程中，如果可溶性蛋白生物標(biāo)志物出現(xiàn)這種情況，就會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物濃度的假性升高以及測(cè)試結(jié)果的變異性增加。例如，在測(cè)定PDGF或VEGF等生長(zhǎng)因子時(shí)，應(yīng)注意選擇最合適的樣本類型，以避免樣本的處理過程非特異性地激活血小板并釋放蛋白質(zhì)進(jìn)入到樣本中。對(duì)于這些待測(cè)物，血漿是比血清更合適的樣本基質(zhì)。
有研究表明，在分析前樣本的處理過程中，室溫保存會(huì)顯著改變血液樣本中IL-8的濃度。室溫孵育會(huì)產(chǎn)生更多的IL-8，導(dǎo)致血液裂解液（blood lysate）樣本中IL-8的濃度不真實(shí)地增加。采集后立即將樣品保存在冰上，而不是室溫下，可以減少這種影響。紅細(xì)胞部分溶解(溶血hemolysis)的血清或血漿樣本并不少見，如果紅細(xì)胞含有高濃度的待測(cè)物的話(例如，aspartate transaminase)，則會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物的錯(cuò)誤數(shù)值。
蛋白質(zhì)的構(gòu)象可以影響檢測(cè)試劑的檢測(cè)能力，這可能由測(cè)試緩沖液中的成分引起。例如，血漿中鈣的螯合作用已被證明會(huì)影響對(duì)鈣結(jié)合蛋白S100A12的檢測(cè)。這樣的干擾可以通過使用不依賴于陽(yáng)離子結(jié)合而能檢測(cè)待測(cè)物的檢測(cè)試劑，或在樣本中加入陽(yáng)離子，或選擇不引起金屬螯合的樣本制備方法（例如肝素鈉血漿或血清）來減輕。
在某些情況下，樣本的物理特性會(huì)使移液變得困難，這種情況或?qū)⒃跍y(cè)試過程中引入干擾。例如，痰的粘度很高，以至于不能實(shí)現(xiàn)精確的移液。通過對(duì)常規(guī)的痰液采用黏液溶解劑dithiothreitol處理，可以降低總粘度；同時(shí)，還必須考慮dithiothreitol的濃度及其對(duì)免疫測(cè)試試劑和待測(cè)物完整性的潛在影響。
此外，一些血漿或尿液樣本中不溶性沉淀物引起的高渾濁度會(huì)引入干擾或高背景信號(hào)，可以通過離心或過濾來減少沉淀物，諸如此類的方法可以減少基質(zhì)干擾，并盡量減少由機(jī)械性錯(cuò)誤引起的誤差。
特異性
如上所述，對(duì)分析方法特異性的錯(cuò)誤解釋是基質(zhì)干擾的主要原因。一個(gè)可溶性蛋白生物標(biāo)志物可能有不同的高度同源的家族成員，異構(gòu)體或前體蛋白（precursor proteins）。如果一個(gè)結(jié)構(gòu)上與實(shí)際待測(cè)物相關(guān)的蛋白質(zhì)，而且免疫分析系統(tǒng)中的捕獲試劑和檢測(cè)試劑都能識(shí)別，那它就會(huì)導(dǎo)致可溶性蛋白生物標(biāo)志物出現(xiàn)錯(cuò)誤的高濃度結(jié)果（例如，一種商用的PDGF-BB測(cè)試方法也檢測(cè)到10%的PDGF-AB）。
Periostin是嗜酸性氣道炎癥的生物標(biāo)志物，具有多種亞型；在分析方法的開發(fā)過程中，明確定義了該方法對(duì)于這些異構(gòu)體的特異性。一些用于medullary thyroid carcinoma診斷的calcitonin分析方法，似乎也部分檢測(cè)到了pro-calcitonin，但后者對(duì)于medullary thyroid carcinoma沒有診斷價(jià)值。
如果只有捕獲試劑（或均相分析中的檢測(cè)試劑）與待測(cè)物相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合，則可能導(dǎo)致待測(cè)物的錯(cuò)誤的低測(cè)定值。可以通過了解相關(guān)生物系統(tǒng)來理解和管理這樣的干擾。例如：確定潛在的交叉反應(yīng)因子及其相對(duì)濃度和親和性、選擇對(duì)待測(cè)物盡可能特異性的試劑、稀釋樣品（其可能將相關(guān)干擾蛋白的濃度降低到測(cè)試方法的檢出限以下）。
另一種可能的方法是通過添加一種特定的試劑來消耗或中和系統(tǒng)中的干擾異構(gòu)體或家族成員蛋白，這種試劑只壓制（suppression）相關(guān)蛋白，而不壓制待測(cè)物本身。
結(jié)合蛋白
可溶性受體或其它直接與待測(cè)物結(jié)合的蛋白質(zhì)的存在可能導(dǎo)致分析信號(hào)的改變，因?yàn)樗鼈兛赡茉贚BA測(cè)試中，阻斷或加強(qiáng)與捕獲或檢測(cè)試劑的相互作用。例如，IL-6可與IL-6R和gp130形成復(fù)合物，可根據(jù)檢測(cè)試劑的不同，可以檢測(cè)到不同性質(zhì)的IL-6。通過選擇測(cè)試試劑，其結(jié)合待測(cè)物，但不與樣本中干擾蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，則可以減少可溶性受體或結(jié)合蛋白引起的干擾，特別是當(dāng)引起干擾的相互作用的親和力低時(shí)，稀釋可以減少干擾。如果不可行，其他可能的方法涉及破壞待測(cè)物和結(jié)合蛋白或可溶性受體之間的結(jié)合。例如，酸解離可以從類胰島素生長(zhǎng)因子與其結(jié)合蛋白的復(fù)合物中解離出類胰島素生長(zhǎng)因子，在中和樣本之前加入結(jié)合蛋白的抑制劑可以進(jìn)一步減少干擾。
對(duì)此類樣本預(yù)處理，應(yīng)嚴(yán)格評(píng)估其對(duì)測(cè)試試劑或待測(cè)物表位的影響。由于此類基質(zhì)干擾可能難以完全消除，因此，最重要的是了解測(cè)試試劑的特異性以及檢測(cè)到的待測(cè)物的各種復(fù)合物，以便據(jù)此解釋測(cè)試結(jié)果。
內(nèi)源性抗體
如前所述，heterophilic抗體和抗動(dòng)物抗體可以結(jié)合主要是動(dòng)物來源的抗體測(cè)試試劑；從而導(dǎo)致不真實(shí)的高或低結(jié)果。人抗小鼠抗體是最常見的人抗動(dòng)物抗體類型，可以結(jié)合夾心式LBA方法中的捕獲和/或檢測(cè)試劑（取決于產(chǎn)生試劑的物種）。與這兩種試劑結(jié)合會(huì)導(dǎo)致試劑橋接和特定待測(cè)物的假陽(yáng)性結(jié)果；與其中的一種結(jié)合，則可能會(huì)破壞待測(cè)物的結(jié)合并導(dǎo)致假陰性結(jié)果。減少heterophilic抗體或人抗動(dòng)物抗體干擾的最常見方法是添加動(dòng)物免疫球蛋白（純化或來自正常動(dòng)物血清中的）或其他商用試劑（例如heterophile的阻斷劑），這些試劑對(duì)heterophilic抗體具有特異的活性。
此外，對(duì)蛋白質(zhì)生物標(biāo)記的抗體（自體抗體autoantibodies）可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的低或高信號(hào)。例如，針對(duì)thyroxine的自體抗體，存在于Hashimoto’s thyroiditis等疾病中，并在一個(gè)thyroxine競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試方法中與fluorescein-T4示蹤劑結(jié)合，導(dǎo)致thyroxine測(cè)定值偏低。
均相的測(cè)定方法（homogenous assays）可能比sequential assays更容易受到這種干擾。選擇來自兩個(gè)不同物種的試劑來捕獲和檢測(cè)待測(cè)物，也可能有助于減少人抗動(dòng)物抗體的橋接干擾。另一種方法是對(duì)樣本進(jìn)行足夠的稀釋以消除干擾。使用G蛋白去除干擾抗體，或使用detergent破壞嗜異性抗體的相互作用。這些和其它改變樣本的處理可能會(huì)產(chǎn)生問題，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)意外地移除待測(cè)物或影響測(cè)試試劑。
其它樣品成分
歷史上，測(cè)定吸光度或光散射的臨床測(cè)試方法受高脂(脂血癥lipidemia)或膽紅素(黃疸icterus)樣本的影響，而LBA方法則不受影響。然而，膽紅素降低了一個(gè)檢測(cè)b型人絨毛膜促性腺激素和IgG的商業(yè)化的檢測(cè)方法所測(cè)定的數(shù)值，干擾可能來自預(yù)料之外的地方。
例如，胰腺囊腫液中的蛋白酶可以降解待測(cè)物和試劑抗體，蛋白酶也被懷疑干擾了痰標(biāo)本中IL-5的檢測(cè)，因?yàn)樘砑拥鞍酌敢种苿┰黾恿薎L-5的檢測(cè)數(shù)值。有趣的是，在使用治療劑量后，發(fā)現(xiàn)樣本中的biotin對(duì)幾個(gè)測(cè)試方法產(chǎn)生了巨量干擾。
游離和總體靶標(biāo)分析是針對(duì)可溶性抗原抗體藥物最常用的靶標(biāo)結(jié)合生物標(biāo)志物。如果一個(gè)靶標(biāo)的可溶性形式進(jìn)入血液，或者膜結(jié)合靶標(biāo)的可溶性異構(gòu)體可能存在于血液循環(huán)中，則游離和總體靶標(biāo)分析數(shù)據(jù)也可作為針對(duì)膜抗原抗體的替代靶標(biāo)結(jié)合生物標(biāo)志物。
抗體藥物對(duì)游離的靶標(biāo)的壓制（suppression）是衡量靶標(biāo)結(jié)合效的直接表現(xiàn)。使用抗體藥物治療后，由于與抗體藥物結(jié)合后靶標(biāo)清除率降低，總體靶標(biāo)通常在血液循環(huán)系統(tǒng)中累積。由于靶標(biāo)結(jié)合與其清除率之間的這種關(guān)系，靶標(biāo)總數(shù)間接地說明了靶標(biāo)的結(jié)合程度。此外，從總體靶標(biāo)累積的數(shù)據(jù)，可以通過PK/PD模擬對(duì)游離靶標(biāo)的壓制。定量分析游離和總體靶標(biāo)，除了面臨所有對(duì)可溶性蛋白生物標(biāo)志物的挑戰(zhàn)外，還面臨獨(dú)特的挑戰(zhàn)。
關(guān)鍵術(shù)語(yǔ)
游離可溶性靶標(biāo)的定量方法：衡量靶標(biāo)參與度的測(cè)試方法。由于游離的藥物和與藥物靶標(biāo)結(jié)合的藥物之間的動(dòng)態(tài)平衡在樣本孵育過程中發(fā)生變化，這種測(cè)定方法尤其受到檢測(cè)程序本身的干擾。
游離可溶性靶標(biāo)的分析方法
大多數(shù)測(cè)定游離可溶性靶點(diǎn)的方法都是基于捕獲試劑與抗體藥物競(jìng)爭(zhēng)與靶點(diǎn)結(jié)合的原理。測(cè)試方法的特異性和對(duì)靶標(biāo)生物學(xué)的理解是建立可靠的游離靶標(biāo)分析方法的關(guān)鍵。預(yù)期對(duì)這類方法的干擾與先前討論的生物標(biāo)志物方法相同。此外，游離靶標(biāo)的定量還會(huì)受到與方法的特異性，樣本稀釋，抗體藥物/靶標(biāo)復(fù)合物的無(wú)意解離、孵育時(shí)間和捕獲試劑的濃度相關(guān)的干擾。
對(duì)游離靶標(biāo)的定量分析中，靶標(biāo)可能不僅與抗體藥物結(jié)合，而且還與內(nèi)源的可溶性受體或結(jié)合蛋白相互作用。在某些情況下，它們與靶標(biāo)結(jié)合的親和力與抗體藥物相當(dāng)。此外，靶標(biāo)蛋白的不同亞型不一定與抗體藥物結(jié)合，因而不一定被被檢測(cè)到。
確認(rèn)一個(gè)方法能檢測(cè)到的靶標(biāo)組分（fraction of target）是至關(guān)重要的。它既可以是未結(jié)合抗體藥物的組分（therapeutic antibody-unbound fraction），也可以是未結(jié)合抗體藥物和結(jié)合蛋白的組分（the binding protein- and therapeutic antibody-unbound fraction）。在這兩種情況下，可能有必要在研究期間評(píng)估結(jié)合蛋白水平的變化，以適當(dāng)?shù)亟忉寯?shù)據(jù)。此外，了解結(jié)合蛋白是否抑制靶標(biāo)蛋白以及結(jié)合蛋白是否與藥物抗體競(jìng)爭(zhēng)與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合，也是至關(guān)重要的，由于一些靶標(biāo)擁有多個(gè)結(jié)合蛋白，因此應(yīng)該將體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)放在對(duì)游離靶標(biāo)結(jié)果有影響的結(jié)合蛋白上。
許多LBA方法依靠稀釋樣本來減少未知來源的基質(zhì)干擾。在游離靶標(biāo)的分析中，稀釋樣本改變了游離靶標(biāo)與藥物結(jié)合的靶標(biāo)以及與血液循環(huán)中結(jié)合蛋白或可溶性受體結(jié)合的靶標(biāo)之間的動(dòng)態(tài)平衡。此問題有兩種解決方案：1.開發(fā)不需要稀釋樣本的分析方法; 2.稀釋樣本并恰當(dāng)?shù)貓?bào)告結(jié)果。如果可行，始終優(yōu)先考慮在未稀釋的樣本中定量分析游離的靶標(biāo)。
在未稀釋的樣本中消除基質(zhì)干擾是一項(xiàng)困難的工作，因?yàn)樯锘|(zhì)是復(fù)雜的，并且在血漿和血清中總蛋白濃度很高。測(cè)量未稀釋樣本的一種方法是使用與樣本基質(zhì)相似的緩沖液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，這將導(dǎo)致對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本相同的基質(zhì)效應(yīng)，因此測(cè)試結(jié)果不會(huì)受基質(zhì)的影響。這個(gè)方法只有在單個(gè)樣本之間的基質(zhì)干擾相對(duì)穩(wěn)定的情況下才會(huì)有效，生成這種測(cè)試基質(zhì)最準(zhǔn)確的方法是將所有待測(cè)物消耗掉，并避免depleting reagent進(jìn)入樣本基質(zhì)。使用來自其它物種的血清或血漿（例如，胎牛血清）通常是足夠的，因?yàn)樗鼈儾慌c捕獲試劑結(jié)合，或者在均相分析中也不與檢測(cè)試劑結(jié)合。從操作的角度來看，未稀釋的血清或血漿樣品是粘稠的，在移液和稀釋過程中需要格外小心，以確保測(cè)試的準(zhǔn)確度和精密度。
從稀釋的樣本中準(zhǔn)確地得出游離待測(cè)物的濃度也具有一定的可能性。在一個(gè)雙組分系統(tǒng)中，抗體藥物和親和力與豐度是已知的，因此可以預(yù)估對(duì)稀釋樣本中待測(cè)物濃度的影響。對(duì)于平衡擾動(dòng)對(duì)測(cè)定游離激素的影響有詳細(xì)的研究。圖2顯示了一個(gè)簡(jiǎn)單的、在不同的靶標(biāo)/抗體藥物比值下樣本稀釋的模擬。對(duì)于親和力為0.1nM的典型抗體，靶標(biāo)濃度為5 nM，對(duì)于靶標(biāo)/抗體藥物結(jié)合位點(diǎn)(CDR互補(bǔ)性確定區(qū)域)比例為1:3或更高的情況，未經(jīng)稀釋調(diào)整的濃度是相當(dāng)準(zhǔn)確的。對(duì)于CDR與靶標(biāo)濃度比值較高的樣本，較高的稀釋度對(duì)未調(diào)整稀釋的濃度（non-dilution-adjusted concentration）的影響不大。也可以通過模擬不同體內(nèi)情況下的體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證數(shù)據(jù)報(bào)告的策略。對(duì)于在藥物wash-out period結(jié)束時(shí)收集的樣本，即當(dāng)抗體藥物和靶標(biāo)濃度趨于一致時(shí)，報(bào)告未稀釋調(diào)整的數(shù)據(jù)將是不準(zhǔn)確。在上面的例子中，當(dāng)CDR與靶標(biāo)的摩爾比值為1:1時(shí)，未經(jīng)稀釋調(diào)整的數(shù)據(jù)是不準(zhǔn)確的。在相關(guān)研究中，必須定義一個(gè)客觀標(biāo)準(zhǔn)，只在合適的時(shí)間點(diǎn)報(bào)告未經(jīng)稀釋調(diào)整的濃度數(shù)據(jù)。
圖2. 在不同靶標(biāo)-抗體濃度比值下，樣本稀釋對(duì)游離靶標(biāo)的濃度的影響。假設(shè)：解離常數(shù)（KD）= 0.1 nM；樣本中的待測(cè)物濃度為5 nM；抗體藥物的CDR是1-，3-，10-，30-或100-倍于靶標(biāo)的摩爾濃度
此外，測(cè)試試劑會(huì)引入一個(gè)誤差，因?yàn)榻Y(jié)合的和游離的靶標(biāo)之間的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)發(fā)生漂移（當(dāng)存在額外的結(jié)合試劑，即捕獲試劑的時(shí)候）。這種所謂的觀察者效應(yīng)（observer effect）解釋了一個(gè)物理原理：觀察的行為會(huì)改變被觀察的現(xiàn)象。
雖然這一原理與可溶性蛋白生物標(biāo)志物的定量分析幾乎無(wú)關(guān)；然而，這一原理卻非常適用于游離靶標(biāo)的定量分析，在總體靶標(biāo)濃度高、游離靶標(biāo)濃度低的樣本中體現(xiàn)得尤其如此。在抗體藥物給藥后，由于與抗體結(jié)合后靶標(biāo)的系統(tǒng)清除率降低，總體靶標(biāo)常在血液循環(huán)系統(tǒng)中累積。
對(duì)游離靶標(biāo)最佳的定量分析方法應(yīng)該使用最少量的捕獲試劑和較短的孵育時(shí)間，以最小化對(duì)平衡的干擾。然而，這種方法降低了測(cè)試方法的精密度、穩(wěn)健性和線性范圍。因此，最好研究觀察者效應(yīng)的程度，并在游離靶標(biāo)分析的準(zhǔn)確度和實(shí)用性之間找到一個(gè)平衡。
如果捕獲試劑與抗體藥物相同或非常相似，ADA就會(huì)干擾游離靶標(biāo)的定量。在這種情況下，ADA不僅與抗體藥物結(jié)合，而且還結(jié)合并阻斷捕獲試劑，因此很少或沒有游離靶標(biāo)能與捕獲試劑結(jié)合，導(dǎo)致游離靶標(biāo)的濃度大幅降低。這一效應(yīng)可能導(dǎo)致即使在沒有抗體藥物的情況下，靶標(biāo)也被壓制的假象，有鑒于此，應(yīng)當(dāng)避免將抗體藥物作為捕獲試劑使用。
在藥物開發(fā)早期，可能沒有合適的試劑。如果抗體藥物的免疫原性非常低，或者是單劑量給藥的研究，在免疫系統(tǒng)開始產(chǎn)生ADA之前抗體藥物就被清除了，則可以將抗體藥物作為捕獲試劑。亦可將ADA為陽(yáng)性的個(gè)人的游離靶標(biāo)數(shù)據(jù)排除在最終的數(shù)據(jù)分析之外。此外，在臨床前研究中，可以從樣本中剔除包括潛在的ADA在內(nèi)的動(dòng)物抗體。
可溶性靶標(biāo)總量的分析方法
抗體藥物經(jīng)常干擾可溶性靶標(biāo)總量的測(cè)定。即使捕獲和檢測(cè)抗體的表位與抗體藥物的表位都不重疊，仍然經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)干擾?？贵w藥物可能改變靶標(biāo)的構(gòu)象或與兩個(gè)靶標(biāo)分子交聯(lián)（crosslink），導(dǎo)致靶標(biāo)總量的高估或低估。為了規(guī)避這一效應(yīng)，可以在樣本中加入過量的抗體藥物，將所有游離的可溶性靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為藥物-靶標(biāo)復(fù)合物。添加過量的抗體藥物后，就可以使用針對(duì)靶標(biāo)-藥物復(fù)合物的定量分析系統(tǒng)來測(cè)定靶標(biāo)總量。在這種情況下，ADA可能結(jié)合抗體藥物造成干擾，可通過形成多聚體復(fù)合物（multimeric complexes）來阻斷檢測(cè)（inhibit detection）或放大特定的檢測(cè)信號(hào)。
Salimi-Moosavi等人證明，研究樣本的堿性或酸性/guanidine 處理均可將抗體藥物產(chǎn)生不可逆變性，而靶標(biāo)在樣本中和后，則可恢復(fù)免疫反應(yīng)性。這樣的預(yù)處理能有效地消除抗體藥物的所有干擾（這種方法能廣泛應(yīng)用于其他蛋白靶標(biāo)和抗體藥物，那將會(huì)很有意義）。
另一種方法是將僅使用一種非競(jìng)爭(zhēng)性抗體和治療性抗體作為試劑，使用非競(jìng)爭(zhēng)性抗體捕獲靶點(diǎn)游離或結(jié)合在治療性抗體上。靶標(biāo)和治療性抗體,然后篩選了酸、中和和涂布到聚苯乙烯板上。進(jìn)而用標(biāo)記的治療性抗體檢測(cè)被包裹的靶點(diǎn)。
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