在競(jìng)爭(zhēng)日益激烈的制藥行業(yè)，按照法規(guī)、指南等傳統(tǒng)模式進(jìn)行生物分析，已經(jīng)無(wú)法適應(yīng)不斷增長(zhǎng)的資源、時(shí)間、生產(chǎn)效率和加速?zèng)Q策的需求。通過(guò)一個(gè)分級(jí)驗(yàn)證適合其用途的PK LBA方法的方式，可以在生物藥開(kāi)發(fā)的早期階段做出科學(xué)合理的決策，從而提高新藥開(kāi)發(fā)的效率。
本文將著重介紹并描述PK LBA方法中校準(zhǔn)曲線(xiàn)的設(shè)計(jì)、生成、編輯以及擬合模型和權(quán)重選擇的相關(guān)思考和建議。由于篇幅有限，本文將采用上下篇的形式來(lái)展開(kāi)論述，敬請(qǐng)垂注！
1.導(dǎo)論
校準(zhǔn)曲線(xiàn)（Calibration curve）代表了檢測(cè)到的響應(yīng)變量與標(biāo)準(zhǔn)參照（比）物（reference standard）濃度之間的關(guān)系，這個(gè)關(guān)系假定了該標(biāo)準(zhǔn)參照物能夠代表真實(shí)測(cè)試樣本中的目標(biāo)分析物（analyte of interest）或待測(cè)物。
校準(zhǔn)曲線(xiàn)用于通過(guò)插值計(jì)算定量地測(cè)定樣本中未知濃度的待測(cè)物。校準(zhǔn)曲線(xiàn)的產(chǎn)生，是通過(guò)將待測(cè)物加入被判斷為能真實(shí)地代表樣本的基質(zhì)中而形成校準(zhǔn)品，隨后依照未知樣本和質(zhì)量控制樣品（QC）的儀器讀出值，然后根據(jù)校準(zhǔn)（或標(biāo)準(zhǔn)）曲線(xiàn)進(jìn)行內(nèi)插從而計(jì)算未知樣本的濃度。
為了優(yōu)化擬合非線(xiàn)性校準(zhǔn)曲線(xiàn)，應(yīng)當(dāng)考慮三個(gè)因素：
（1）擬合平均濃度與響應(yīng)的關(guān)系；
(2)對(duì)非線(xiàn)性劑量-響應(yīng)曲線(xiàn)中的已知差異率（heteroscedasticity/non-constant response-error relationship，非恒定的響應(yīng)-誤差關(guān)系）使用適當(dāng)?shù)臋?quán)重；
(3)使用適當(dāng)?shù)那€(xiàn)擬合算法來(lái)估算擬合的參數(shù)。
對(duì)樣本定量的準(zhǔn)確度取決于該分析方法的校準(zhǔn)曲線(xiàn)的穩(wěn)健性和可重復(fù)性，該分析方法反過(guò)來(lái)又取決于參照（比）物（reference material）和其他測(cè)試組分（assay component）的性能。應(yīng)該在方法開(kāi)發(fā)階段中徹底評(píng)估配體結(jié)合式測(cè)試（LBA）方法的組成成分（即試劑）的性能特性，這些包括但不限于固體或固定的表面（如96孔板）和捕獲/檢測(cè)抗體。同時(shí)，應(yīng)當(dāng)制定適當(dāng)?shù)挠?jì)劃，以監(jiān)控批次間相關(guān)試劑的一致性。
此外，相關(guān)法規(guī)指導(dǎo)文件和該領(lǐng)域?qū)＜野l(fā)表的指導(dǎo)性文件中定義了設(shè)計(jì)校準(zhǔn)曲線(xiàn)的一般要求、校準(zhǔn)樣品的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)以及如何選擇適當(dāng)?shù)幕貧w模型。遵守這些已發(fā)布的準(zhǔn)則和要求可提高校準(zhǔn)曲線(xiàn)的可重復(fù)性（跨運(yùn)行和跨研究）。
總之，每個(gè)生物分析實(shí)驗(yàn)室都有責(zé)任在其標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOPs）中定義LBA校準(zhǔn)曲線(xiàn)的設(shè)計(jì)、產(chǎn)生、驗(yàn)收和編輯標(biāo)準(zhǔn)。本文旨在為產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線(xiàn)以及處理校準(zhǔn)品數(shù)據(jù)點(diǎn)提供建議和最佳做法。雖然本文的內(nèi)容也可能適用于某些生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法，但其重點(diǎn)仍然是用于定量藥代動(dòng)力學(xué)(PK)的LBAs的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。其他所有的測(cè)試類(lèi)型或格式都暫不討論。
LBAs和色譜分析方法的校準(zhǔn)曲線(xiàn)之間存在著關(guān)鍵區(qū)別。在LBAs中，儀器響應(yīng)可能與待測(cè)物的濃度呈正比關(guān)系（directly），也可能與待測(cè)物濃度呈反比關(guān)系（inversely），這取決于該分析方法是非競(jìng)爭(zhēng)性還是競(jìng)爭(zhēng)式的。無(wú)論采用何種格式，可以使用半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系（semi-log scale）將曲線(xiàn)轉(zhuǎn)換成響應(yīng)與待測(cè)物濃度之間的S型關(guān)系。這與色譜分析方法不同，在色譜分析中，儀器響應(yīng)通常是濃度的線(xiàn)性函數(shù)，兩者在大多數(shù)校準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)是呈成正比例關(guān)系的。對(duì)于色譜法來(lái)說(shuō)，線(xiàn)性關(guān)系的喪失表明該方法已經(jīng)達(dá)到了它的檢測(cè)極限。
LBAs方法依賴(lài)于待測(cè)物與結(jié)合試劑（如抗體或受體部分）的相互作用，而這與傳統(tǒng)的色譜分析不同，在傳統(tǒng)的色譜分析中，待測(cè)物的檢測(cè)不依賴(lài)于其與某個(gè)大分子的結(jié)合（binding）。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)平衡性質(zhì)導(dǎo)致了LBAs的非線(xiàn)性響應(yīng)。此外，由于LBAs的效能在很大程度上取決于其所使用的生物試劑的性能，因此其檢測(cè)結(jié)果往往表現(xiàn)出較大的變異性（variance）。
非線(xiàn)性的LBA校準(zhǔn)曲線(xiàn)限制了曲線(xiàn)上端和下端的濃度-響應(yīng)的相關(guān)性，使得曲線(xiàn)處于平臺(tái)狀態(tài)，因此形成S型曲線(xiàn)。在典型的sigmoidal校準(zhǔn)曲線(xiàn)中，下部平臺(tái)（漸近線(xiàn)asymptote）及其附近代表了背景響應(yīng)，上部平臺(tái)代表接近最大響應(yīng)。通常認(rèn)為4PL模型是擬合此形狀校準(zhǔn)曲線(xiàn)的首選。另外，在校準(zhǔn)曲線(xiàn)的漸近線(xiàn)(上、下平臺(tái)部分)上進(jìn)行定量將導(dǎo)致產(chǎn)生較差的精密度和準(zhǔn)確度。這些特性最終縮小了LBA方法的有效定量范圍，使得選擇合適的非線(xiàn)性數(shù)據(jù)擬合算法變得更加重要。
有多種商業(yè)軟件可用來(lái)執(zhí)行LBAs的非線(xiàn)性回歸。大多數(shù)分析儀器制造商均有提供與設(shè)備兼容的非線(xiàn)性回歸軟件。實(shí)驗(yàn)室可選擇安裝獨(dú)立軟件或使用其實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)(LIMS)來(lái)進(jìn)行回歸擬合，具體取決于哪種軟件更能滿(mǎn)足其需要和要求。
用于擬合LBA校準(zhǔn)曲線(xiàn)的軟件應(yīng)該具有使用4個(gè)和5個(gè)參數(shù)logistic模型（Four and five parameter logistic regression，4和5 PL）進(jìn)行回歸分析的能力，并且能夠：
當(dāng)前，一些生物分析指南或法規(guī)文件的生物分析部分已經(jīng)對(duì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的最低要求進(jìn)行了確定。這些指導(dǎo)性文件對(duì)LBA曲線(xiàn)的需求和性能預(yù)期通常是相互一致的。表1總結(jié)了來(lái)自美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)、歐洲藥品管理局(EMA)、日本衛(wèi)生、勞動(dòng)和福利部(MHLW)和巴西衛(wèi)生監(jiān)管機(jī)構(gòu)(ANVISA)對(duì)校準(zhǔn)曲線(xiàn)的要求。FDA和EMA指南是絕大多數(shù)生物分析實(shí)驗(yàn)室遵從的主要指南。各個(gè)制藥廠(chǎng)商應(yīng)根據(jù)各自計(jì)劃所提交的新藥審核監(jiān)管機(jī)構(gòu)來(lái)決定自身需要遵從的指南法規(guī)。
校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品（Calibrator standards）是通過(guò)將已知濃度的參照（比）藥物加入到與研究樣本基質(zhì)相同或一致的，經(jīng)過(guò)認(rèn)證的基質(zhì)（matrix）中而產(chǎn)生的。這些校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——響應(yīng)關(guān)系則確定了該測(cè)試方法的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。在涉及多種藥物聯(lián)合使用的研究中，研究樣本中的每個(gè)待測(cè)物都需要一條校準(zhǔn)曲線(xiàn)。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的制備必須獨(dú)立于質(zhì)量控制樣品（QCs），以避免潛在的藥物加入造成誤差的擴(kuò)散或放大。
這意味著校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和QCs可能不能使用相同中間庫(kù)存的藥物參照（比）品來(lái)制備，但可以通過(guò)連續(xù)稀釋藥物參照（比）品的初級(jí)或中級(jí)庫(kù)存來(lái)制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品。制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品不需要在每個(gè)濃度水平上單獨(dú)外加藥物參照（比）品來(lái)制備，盡管這種做法意味著需在更高一級(jí)的水平上對(duì)校準(zhǔn)曲線(xiàn)的質(zhì)量控制，并可以監(jiān)測(cè)外加藥物參照（比）品的精確度。無(wú)論藥物參照（比）品的中間庫(kù)存組成如何，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)包含至少95%的研究樣本基質(zhì)。
使用LBAs方法的期望是在可能的情況下，盡一切努力在生物基質(zhì)中制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，該生物基質(zhì)在物種、組成成份和基質(zhì)預(yù)處理等方面必須與研究樣本的基質(zhì)相匹配。例如，若研究樣本是未經(jīng)過(guò)濾的血清，那么制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)也必須是來(lái)自相同物種的未經(jīng)過(guò)濾的血清。需要注意的是，研究人群通常是伴有相關(guān)的疾病，而校準(zhǔn)品基質(zhì)（calibrator matrix）則是來(lái)自于健康的受試者。如果沒(méi)有其他對(duì)待測(cè)物做定量分析的方法，那么用替代基質(zhì)來(lái)制備校準(zhǔn)品也是合理的，例如當(dāng)研究使用的基質(zhì)稀缺或很難獲得時(shí),當(dāng)研究藥物有內(nèi)源性同源物時(shí),在對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)等。
當(dāng)使用替代基質(zhì)來(lái)制備校準(zhǔn)品時(shí)，該生物分析方法應(yīng)該使用研究樣本基質(zhì)制備的QCs和研究基質(zhì)選擇性樣本（study matrix selectivity sample）進(jìn)行驗(yàn)證，并與替代基質(zhì)中制備的校準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較和評(píng)估。除此之外，還建議分析者進(jìn)行其他試驗(yàn)，以證明替代基質(zhì)與研究基質(zhì)的稀釋曲線(xiàn)兩者之間的可比性。一種普遍接受的方法是測(cè)試上下漸近線(xiàn)、增長(zhǎng)率（growth rate）以及5PL曲線(xiàn)中不對(duì)稱(chēng)因子的等同性。當(dāng)前業(yè)界內(nèi)已提出如何測(cè)試平行性（parallelism）的方法，平行性測(cè)試是一個(gè)評(píng)估LBA方法相對(duì)準(zhǔn)確性的基本實(shí)驗(yàn)。通過(guò)分析稀釋對(duì)基質(zhì)中內(nèi)源性待測(cè)物定量的影響，可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中評(píng)估該測(cè)試方法的選擇性、基質(zhì)效應(yīng)、所需的最小稀釋率、健康和患病人群的內(nèi)源性待測(cè)物的水平以及LLOQ。
這些等效性測(cè)試的接受標(biāo)準(zhǔn)尚未確定，但已在業(yè)界廣泛討論。圖1提供了在人血漿中制備的校準(zhǔn)曲線(xiàn)的示例，同時(shí)也提供了在緩沖液（替代基質(zhì)）中制備的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。它們是兩條平行的曲線(xiàn)。
校準(zhǔn)樣品可用100%或以最低稀釋度(minimum required dilution，MRD)稀釋后的基質(zhì)配制。使用MRD稀釋基質(zhì)的方法的例子包括但不限于罕見(jiàn)基質(zhì)或在自動(dòng)化平臺(tái)上執(zhí)行的方法，在這些平臺(tái)上使用100%基質(zhì)可能會(huì)由于有限的可及性（limited availability）或由于基質(zhì)的粘度而成為問(wèn)題。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)測(cè)試方法性能來(lái)決定校準(zhǔn)樣品是用100%的基質(zhì)還是用MRD稀釋的基質(zhì)制備，應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑u(píng)估，以確保校準(zhǔn)樣品和QC的回收率在理論值的預(yù)期范圍內(nèi)（例如，±20%）。當(dāng)在100%基質(zhì)中制備時(shí)，校準(zhǔn)樣品需要以用于QCs和研究樣本相同的MRD來(lái)稀釋。未知樣品回算的濃度應(yīng)報(bào)告為100%基質(zhì)中的濃度。
在生物分析應(yīng)用中，選擇認(rèn)證后的混合基質(zhì)（qualified matrix pool，QMP）的過(guò)程至關(guān)重要。建議認(rèn)證和儲(chǔ)存足夠的混合基質(zhì)，確保足以用來(lái)完成方法開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證和至少第一次研究中樣本分析。還建議將QMP儲(chǔ)存在與QCs和研究樣本相同的條件下。例如，如果樣本的儲(chǔ)存溫度小于或等于-65℃，則QMP也應(yīng)儲(chǔ)存在該溫度范圍內(nèi)。
在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，可以篩查、選擇和合并單個(gè)基質(zhì)樣本或單個(gè)混合基質(zhì)來(lái)生成QMP，商業(yè)來(lái)源的混合基質(zhì)也可能適用。QMP篩查應(yīng)包括評(píng)估對(duì)未外加和外加了待測(cè)物的基質(zhì)樣品的檢測(cè)信號(hào)。例如，出于篩查的目的，可以在單個(gè)基質(zhì)樣本加入相當(dāng)于LLOQ水平的待測(cè)物。具有高背景或加標(biāo)回收率不合格的基質(zhì)樣品應(yīng)排除在QMP之外?；|(zhì)樣品的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)實(shí)例可以是：使用QMP制備的校準(zhǔn)曲線(xiàn)，至少有80%的所有單個(gè)基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率在理論濃度的80%至120%之間。QMP應(yīng)該能代表研究人群，通過(guò)混合滿(mǎn)足接受標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)體基質(zhì)樣本來(lái)制備。
LBA校準(zhǔn)樣品可以是新鮮制備的或者冷凍的。不少實(shí)驗(yàn)室在所有階段習(xí)慣使用新制備的校準(zhǔn)樣品，包括方法開(kāi)發(fā)、研究前驗(yàn)證和隨后的生物分析。新鮮的校準(zhǔn)樣品可以從原始或中間參考標(biāo)準(zhǔn)的庫(kù)存（original or intermediate reference standard stock）中調(diào)取。如果使用中間參考標(biāo)準(zhǔn)，必須在發(fā)布驗(yàn)證報(bào)告之前確定其穩(wěn)定性。在研究前的方法驗(yàn)證中，使用新制備的校準(zhǔn)樣品來(lái)評(píng)估冷凍的QCs，可以初步建立QCs的穩(wěn)定性。
一旦初步確立了QC的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)室就可以利用這些信息來(lái)制備和儲(chǔ)/凍存單個(gè)校準(zhǔn)樣品。如果將LLOQ和ULOQ樣品包含在穩(wěn)定性測(cè)試中，且穩(wěn)定性測(cè)試窗口覆蓋了校準(zhǔn)樣品的存儲(chǔ)期，則此方法就是可以接受的。預(yù)先認(rèn)證和凍存校準(zhǔn)樣品的目的是減少測(cè)試運(yùn)行之間的變異性和提高操作效率。凍存的校準(zhǔn)樣品應(yīng)分裝在足夠一次性使用的容器中，并應(yīng)避免校準(zhǔn)樣品的反復(fù)融凍。
監(jiān)管機(jī)構(gòu)為校準(zhǔn)曲線(xiàn)的設(shè)計(jì)提供了指南。以下是指南準(zhǔn)則的簡(jiǎn)短總結(jié):
ULOQ和LLOQ分別代表定量分析范圍的上限和下限，必須作為研究前驗(yàn)證的一部分進(jìn)行驗(yàn)證。為了驗(yàn)證LLOQ和ULOQ校準(zhǔn)樣品，僅僅在這些級(jí)別上包括校準(zhǔn)樣品是不夠的，還需要在LLOQ和ULOQ水平上制備驗(yàn)證樣品(QCs)，這些QCs必須包括在研究前驗(yàn)證的準(zhǔn)確度和精密度的評(píng)估中。ULOQ校準(zhǔn)樣品必須分別滿(mǎn)足相對(duì)誤差(RE)為±20%和變異系數(shù)(CV)為≤20%的接受標(biāo)準(zhǔn)；LLOQ校準(zhǔn)樣品則必須分別滿(mǎn)足FDA指南中規(guī)定的±25%的RE和≤25%的CV，才能被納入校準(zhǔn)曲線(xiàn)。一旦經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，LLOQ和ULOQ水平校準(zhǔn)樣品將成為校準(zhǔn)曲線(xiàn)的一個(gè)組成部分，并且必須包括在每次測(cè)試運(yùn)行中。
研究中每個(gè)待測(cè)物在每次分析測(cè)試運(yùn)行應(yīng)當(dāng)有一條校準(zhǔn)曲線(xiàn)，校準(zhǔn)范圍必須適合并符合研究樣品中待測(cè)物的預(yù)期濃度范圍。一般來(lái)說(shuō)，寬大的定量范圍有助于一次性地定量分析含有大范圍待測(cè)物濃度的大量樣本。狹窄的定量范圍則限制了該測(cè)試方法的分析能力，導(dǎo)致不必要的重復(fù)分析，即需要額外稀釋從而使樣本濃度進(jìn)入校準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍。雖然將待測(cè)物濃度為零的校準(zhǔn)樣品定義為不含待測(cè)物的基質(zhì)樣品不是必須的，但可能是有益的。
目前的建議是對(duì)LBA校準(zhǔn)樣品進(jìn)行重復(fù)（duplicate）分析，盡管變化趨勢(shì)如高CVs，可能需要進(jìn)行三次（triplicate）復(fù)測(cè)。只有在該方法的量化范圍內(nèi)證明了原始響應(yīng)的穩(wěn)健性和高精密度的情況下，才能認(rèn)為使用單次測(cè)量（單孔singlicate）是合理的。
2012年EMA生物分析指南中討論了非線(xiàn)性回歸擬合時(shí)錨定點(diǎn)的作用，并在整個(gè)行業(yè)中推薦使用錨定點(diǎn)。錨定點(diǎn)被定義為在測(cè)試方法的定量范圍之上和之下的校準(zhǔn)樣品，但它們不受與校準(zhǔn)曲線(xiàn)點(diǎn)相同的性能要求的約束。錨定點(diǎn)的價(jià)值和在回歸分析時(shí)使用錨定點(diǎn)并不是被普遍接受的，但是建議將它們作為方法開(kāi)發(fā)過(guò)程的一部分，并評(píng)估它們對(duì)改善整體回歸分析的作用。
使用錨定點(diǎn)是否能改善曲線(xiàn)擬合，應(yīng)基于所提出的數(shù)學(xué)算法或加權(quán)因子，并應(yīng)在個(gè)案基礎(chǔ)上確定。錨定點(diǎn)可能特別有助于增強(qiáng)曲線(xiàn)擬合，不僅在過(guò)度寬大或狹窄的校準(zhǔn)曲線(xiàn)的情況下，而且在使用加權(quán)因子的校準(zhǔn)模型中也是如此。在某些情況下，位于LLOQ以下的錨定點(diǎn)增強(qiáng)了曲線(xiàn)的擬合，并有助于LLOQ滿(mǎn)足其接受標(biāo)準(zhǔn)。
目前監(jiān)管機(jī)構(gòu)尚未就校準(zhǔn)樣品之間的間距和ULOQ/LLOQ信號(hào)比作出明文指導(dǎo)。一般推薦使用相等的校準(zhǔn)樣品的間距，如采用對(duì)數(shù)刻度（例如，on a logarithmic scale of the power of 2），這有利于改善測(cè)試方法的性能。
校準(zhǔn)樣品濃度的選擇部分是基于以下的實(shí)際考慮：即在進(jìn)行多個(gè)測(cè)試運(yùn)行時(shí)，易于制備和無(wú)差錯(cuò)地復(fù)制校準(zhǔn)品濃度。建議分析者使用系列稀釋?zhuān)╯erial dilution）的方法，并使用一個(gè)固定的稀釋比例（使用與被分析的實(shí)際樣本相同的基質(zhì)稀釋校準(zhǔn)品）。最終結(jié)果是，校準(zhǔn)品在濃度范圍的對(duì)數(shù)刻度上的間隔大致均勻/相等的。在這些條件下，Rocke和Jones確定了校準(zhǔn)品的最佳稀釋比例，該比例通常為2：1或3：1。2：1的系列稀釋與6個(gè)校準(zhǔn)品濃度將產(chǎn)生一系列如1X，2X，4X，8X，16X，32X（稀釋倍比為2n: n = 0,1,2,3,4,5的曲線(xiàn)）。對(duì)于典型的響應(yīng)遞減曲線(xiàn)（D<A），Rocke和Jones的研究也顯示，如果使用最佳間距，校準(zhǔn)品濃度曲線(xiàn)的中點(diǎn)應(yīng)略高于預(yù)期的IC50濃度（當(dāng)LBA用于活性測(cè)定時(shí)）。這意味著在曲線(xiàn)較小方差（variance）的區(qū)域有更多的校準(zhǔn)點(diǎn)。對(duì)于上述2：1的稀釋比例，應(yīng)調(diào)整X，以便所預(yù)期的IC50 濃度位于8X稀釋的校準(zhǔn)濃度點(diǎn)附近?？梢蕴砑宇~外的校準(zhǔn)樣品（如果已包括在回歸模型的評(píng)估中）來(lái)更好地定義校準(zhǔn)曲線(xiàn)的拐點(diǎn)（inflection point）。
在LLOQ附近加入更緊密相鄰的校準(zhǔn)樣品可能有助于在LLOQ失效時(shí)，將靈敏度的損失降到最低。在校準(zhǔn)曲線(xiàn)中包含零濃度的校準(zhǔn)樣品不是監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求或標(biāo)準(zhǔn)做法，然而，如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室選擇將零作為校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的一部分，則建議在LLOQ和零校準(zhǔn)樣品之間留有足夠的間距，以保護(hù)LLOQ不會(huì)失敗。例如，2012年的EMA指南規(guī)定LLOQ的信號(hào)至少是空白樣本信號(hào)的5倍。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)測(cè)試方法的效能（performance）為其確定適當(dāng)?shù)拈g距。
ULOQ/LLOQ濃度比受測(cè)試格式（format）、平臺(tái)（platform）和試劑特性的影響。實(shí)驗(yàn)室的目標(biāo)應(yīng)該是最大限度地提高ULOQ/LLOQ濃度比，并可設(shè)定其最低目標(biāo)，如10/1。
選擇一個(gè)合適的非線(xiàn)性回歸模型需要經(jīng)過(guò)多次迭代才能獲得LBA校準(zhǔn)曲線(xiàn)的最佳擬合。目前的監(jiān)管指南是建議使用能夠獲得足夠擬合度的最簡(jiǎn)單模型來(lái)進(jìn)行擬合，建議在評(píng)估任何可能的權(quán)重之前，首先選擇回歸模型。評(píng)估權(quán)重能否減輕不同濃度下測(cè)試響應(yīng)不等同的變異性也很重要。
此外，還需要考慮的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是可報(bào)告的測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量，對(duì)它的考慮應(yīng)該超越對(duì)模型擬合質(zhì)量的考慮，并且可以通過(guò)準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)估。因?yàn)闇?zhǔn)確度概要（Accuracy profile）有助于各種擬合模型的可視化。必須強(qiáng)調(diào)的是，目前的研究文獻(xiàn)不鼓勵(lì)如下操作：（1）使用線(xiàn)性函數(shù)來(lái)近似S形曲線(xiàn)；（2）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（log-log transformation）來(lái)使得固有的非線(xiàn)性關(guān)系近似于線(xiàn)性。
校準(zhǔn)曲線(xiàn)常用的非線(xiàn)性模型是4PL和5PL，可以通過(guò)許多自動(dòng)化軟件實(shí)現(xiàn)擬合。雖然可以使用其他的非線(xiàn)性模型，但須謹(jǐn)慎且應(yīng)對(duì)4PL和5PL模型不適用的特殊情況加以證明。
4PL模型最常見(jiàn)的參數(shù)化形式是：
其中yj是對(duì)應(yīng)濃度xj的響應(yīng)，a為上漸近線(xiàn)，d為下漸近線(xiàn)，c為曲線(xiàn)拐點(diǎn)處的濃度，b為生長(zhǎng)因子。該模型的一個(gè)特點(diǎn)是拐點(diǎn)附近的對(duì)稱(chēng)性，而拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)于d和a之間距離的一半。這個(gè)模型雖然也可應(yīng)用，但它通常產(chǎn)生的是一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的校準(zhǔn)曲線(xiàn)，因而需要使用5PL模型擬合。
5PL模型的一般參數(shù)化形式是：
其中g(shù)是不對(duì)稱(chēng)因子。當(dāng)g=1時(shí)，5PL函數(shù)與4PL函數(shù)完全等價(jià)。圖2說(shuō)明了4PL和5PL曲線(xiàn)之間的差異。
LBA校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的另一個(gè)常見(jiàn)挑戰(zhàn)是不同校準(zhǔn)樣品濃度下響應(yīng)的不相等變異性（unequal variability），即響應(yīng)的噪聲（variance）通常不是恒定的，而是隨著響應(yīng)而變化，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為異方差性（heteroscedasticity），可以通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行加權(quán)處理，使其與濃度范圍內(nèi)響應(yīng)的可變性成比例。如果應(yīng)對(duì)異方差性得當(dāng)，校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的質(zhì)量則可以提高。應(yīng)對(duì)的基本思想是在表現(xiàn)出較高變異的響應(yīng)上減少其"權(quán)重"。換句話(huà)說(shuō)，校準(zhǔn)曲線(xiàn)與低變異數(shù)據(jù)更緊密地?cái)M合，并允許稍微偏離較高變異的數(shù)據(jù)，以這種方式加權(quán)可得到更寬泛的定量范圍，并在該范圍內(nèi)提高準(zhǔn)確度和精密度。如果不使用適當(dāng)?shù)臋?quán)重，將會(huì)導(dǎo)致LLOQ和ULOQ附近的插值有更大的偏差（bias）和不精密度（imprecision）。適當(dāng)使用權(quán)重可以減少重復(fù)測(cè)試的響應(yīng)值中的不相等方差（unequal variance）。
大多數(shù)軟件都具有執(zhí)行加權(quán)回歸所需的功能。軟件通常會(huì)選擇常用的權(quán)重，如1/Y和1/Y2，并通過(guò)評(píng)估響應(yīng)-誤差關(guān)系（response-error relation）來(lái)選擇最佳的權(quán)重函數(shù)。1/Y的權(quán)重增強(qiáng)了曲線(xiàn)底部的點(diǎn)，1/Y2的權(quán)重增強(qiáng)了曲線(xiàn)頂部和底部的點(diǎn)。還有其他權(quán)重因子和加權(quán)方法也同樣可以使用，并可能能夠更好地滿(mǎn)足特定測(cè)試方法的需求。
雖然曲線(xiàn)的非對(duì)稱(chēng)性和異方差性（heteroscedasticity）是曲線(xiàn)擬合的重要考慮因素，但如果沒(méi)有適當(dāng)?shù)念A(yù)評(píng)估，將它們包含在模型中可能會(huì)導(dǎo)致擬合一個(gè)過(guò)于復(fù)雜的模型。在校準(zhǔn)曲線(xiàn)中包含反映測(cè)試方法自然變化的參數(shù)可能會(huì)導(dǎo)致回算誤差和增加所報(bào)告的結(jié)果的偏差（bias）。
做回歸分析時(shí)，有許多不同的方法可用于統(tǒng)計(jì)評(píng)估模型擬合的質(zhì)量。（包括R2和均方誤差（root mean square error）。但這些參數(shù)并非適用于所有情況，它們的設(shè)計(jì)目的是將響應(yīng)的誤差最小化，而不是將所報(bào)告的結(jié)果的誤差最小化。此外，Anscombe’s quartet表明，高度不同的數(shù)據(jù)可以獲得相似的擬合質(zhì)量，但并不能保證反向預(yù)測(cè)的相似。準(zhǔn)確度曲線(xiàn)（accuracy profile）是一種基于未來(lái)可報(bào)告結(jié)果的替代性圖形方法，它將各濃度水平下測(cè)試所得的可報(bào)告結(jié)果與真實(shí)值之間相對(duì)差異的b-期望容差區(qū)間（b-expectation tolerance interval）聯(lián)系起來(lái)。
b-期望容差區(qū)間被定義為某個(gè)比例(b%)的未來(lái)結(jié)果預(yù)期會(huì)下降的區(qū)間。該工具可以方便地可視化偏差、精密度和定量限（limit of quantitation，LOQ/定量限，在這里準(zhǔn)確度超出了可接受的范圍），提供了一種可以用來(lái)比較多個(gè)模型的簡(jiǎn)單方法，并方便從中選擇精度最高的可報(bào)告結(jié)果的模型。
圖4給出了兩條不同的校準(zhǔn)曲線(xiàn)及其基于15%相對(duì)誤差的相關(guān)準(zhǔn)確度曲線(xiàn)（RE，定義為實(shí)驗(yàn)值和理論值之間的差值與理論值之比）的接受極限（acceptance limit）。15%相對(duì)誤差的接受極限是指南推薦的。
至少有75%的校準(zhǔn)樣品，包括LLOQ和ULOQ校準(zhǔn)樣品，按回算濃度，必須通過(guò)接受標(biāo)準(zhǔn)：即該回算濃度在理論濃度的±20%(低定量限為±25%)的范圍內(nèi)，而CVs低于20%（在低定量限為<<>25%）(另見(jiàn)表1)。對(duì)于每個(gè)校準(zhǔn)樣品，應(yīng)該報(bào)告回算濃度的CVs，而不是儀器響應(yīng)的CVs。首先，應(yīng)該根據(jù)精密度排除校準(zhǔn)樣品。每次排除后，應(yīng)重新對(duì)曲線(xiàn)進(jìn)行回歸分析和評(píng)價(jià)。其次，應(yīng)該一次只排除一個(gè)校準(zhǔn)樣品，并且按偏差大小的順序，從擁有最高偏差（RE）的校準(zhǔn)樣品開(kāi)始。另外，只有在需要時(shí)才排除其他校準(zhǔn)樣品。
屏蔽（masking）被定義為：在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸時(shí)不使用某個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，而該校準(zhǔn)點(diǎn)的數(shù)值仍存在于系統(tǒng)中。在討論曲線(xiàn)編輯時(shí)，屏蔽和排除（exclusion）這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可以互換使用。每個(gè)A校準(zhǔn)點(diǎn)通常是在微孔板的兩個(gè)孔（復(fù)孔）中進(jìn)行重復(fù)（duplicate）測(cè)試。如果曲線(xiàn)擬合是基于復(fù)孔測(cè)試的平均值，則只有當(dāng)兩個(gè)孔的測(cè)試結(jié)果都滿(mǎn)足接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，才能接受該校準(zhǔn)點(diǎn)。在這種情況下，不建議排除一個(gè)孔的數(shù)值，而只使用另一個(gè)孔的結(jié)果。在某些試平臺(tái)，如Singulex，每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)可能測(cè)試三次，在這種情況下，三個(gè)孔中至少有兩個(gè)必須通過(guò)，才能接受該校準(zhǔn)點(diǎn)。
如果LLOQ和ULOQ校準(zhǔn)點(diǎn)的所有重復(fù)測(cè)試都失敗，那么該驗(yàn)證運(yùn)行就失敗了，應(yīng)該調(diào)查失敗的可能原因（EMA 2012）。編輯校準(zhǔn)曲線(xiàn)只能在可以確定失敗原因的情況下進(jìn)行，例如：記錄在案的外加藥物誤差，或移液器誤差，或使用了先驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。校準(zhǔn)曲線(xiàn)的編輯必須獨(dú)立于QC的評(píng)估， 這意味著，不能排除校準(zhǔn)點(diǎn)以方便QC的通過(guò)，除非不符合與校準(zhǔn)樣品相關(guān)的接受標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室必須在其標(biāo)準(zhǔn)操作程序中定義如何屏蔽和編輯校準(zhǔn)點(diǎn)。
屏蔽和排除校準(zhǔn)樣品的一般準(zhǔn)則如下:
一旦測(cè)試運(yùn)行通過(guò)，每個(gè)樣本都可以根據(jù)校準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行評(píng)估。如果一個(gè)未知樣本結(jié)果的CV%可接受，并且平均濃度落在該方法的定量范圍內(nèi)，則該結(jié)果可以被報(bào)告。如果樣本的平均濃度超出了定量范圍，則應(yīng)在適當(dāng)?shù)南♂尯笾匦聹y(cè)試該樣本，以獲得在定量范圍內(nèi)的結(jié)果。如果一個(gè)測(cè)試結(jié)果在定量范圍內(nèi)，而另一個(gè)復(fù)測(cè)結(jié)果低于LLOQ或高于ULOQ，則應(yīng)該報(bào)告平均值，前提是平均值在經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的定量范圍內(nèi)，且CV%是可接受的。樣本濃度結(jié)果應(yīng)報(bào)告為100%的基質(zhì)，在考慮了測(cè)試方法的MRD和任何其它稀釋的倍數(shù)之后。
正如在前一節(jié)中提到的，如果LLOQ校準(zhǔn)點(diǎn)失敗且必須被屏蔽，定量范圍就截?cái)嗟较乱粋€(gè)最低的校準(zhǔn)點(diǎn)。在這種情況下，LQC仍必須由可接受的校準(zhǔn)樣品包含在內(nèi)（bracketed），否則檢測(cè)失敗。如果是ULOQ失敗，曲線(xiàn)的上端向下移動(dòng)到下一個(gè)可接受的校準(zhǔn)點(diǎn)，且必須包含在可接受的校準(zhǔn)樣品內(nèi)，否則檢測(cè)也同樣失敗。如果樣本的測(cè)定值低于LLOQ或高于ULOQ，則必須調(diào)整樣本的稀釋倍數(shù)，再重新分析該樣品，使其測(cè)定值落在定量范圍內(nèi)。
LBA校準(zhǔn)曲線(xiàn)可能容易隨時(shí)間發(fā)生校準(zhǔn)漂移。校準(zhǔn)曲線(xiàn)性能的漂移定義為由于參比標(biāo)準(zhǔn)品、分析試劑和其他測(cè)試組分的反應(yīng)性或結(jié)合特性的變化而導(dǎo)致的校準(zhǔn)偏移。這種變化可能會(huì)改變校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率或其他性質(zhì)，最終導(dǎo)致樣本的濃度報(bào)告為過(guò)高或過(guò)低。同時(shí)，該方法的定量上限和下限，或樣本的稀釋線(xiàn)性，也可能發(fā)生變化。
可能導(dǎo)致校準(zhǔn)曲線(xiàn)性能漂移的因素包括但不限于：(a)新批次的混合基質(zhì)；(b)關(guān)鍵試劑特性（如純度、特異性和捕獲或檢測(cè)抗體的結(jié)合親和力）的變化；(c)含有蛋白質(zhì)或脂質(zhì)添加劑或載體的非關(guān)鍵試劑的性能變化；以及(d)對(duì)參比標(biāo)準(zhǔn)品配方的修改。應(yīng)在方法開(kāi)發(fā)的早期就開(kāi)始監(jiān)測(cè)校準(zhǔn)曲線(xiàn)的性能，并在研究前驗(yàn)證和樣本分析階段繼續(xù)進(jìn)行。此外，在多個(gè)臨床研究的時(shí)間跨度上，跟蹤校準(zhǔn)漂移是至關(guān)重要的。但是，目前還沒(méi)有用于監(jiān)測(cè)校準(zhǔn)曲線(xiàn)性能的共識(shí)或已經(jīng)建立的方法。
監(jiān)測(cè)校準(zhǔn)曲線(xiàn)漂移的建議包括:
旨在確定藥物濃度以支持藥代動(dòng)力學(xué)研究的，高質(zhì)量和可靠的配體結(jié)合測(cè)試方法（LBA）在生物藥的開(kāi)發(fā)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在典型的LBA方法中，使用校準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)內(nèi)插值（interpolate）測(cè)定質(zhì)量控制樣品和未知樣品中的藥物濃度。對(duì)大多數(shù)LBA方法，預(yù)計(jì)測(cè)試信號(hào)與藥物濃度的關(guān)系是非線(xiàn)性的。因此，建議應(yīng)用多參數(shù)，通常為4或5參數(shù)Logistic regression (4PL或5PL)的數(shù)學(xué)方法，在定量范圍內(nèi)，擬合至少6個(gè)校準(zhǔn)樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)以獲得校準(zhǔn)曲線(xiàn)?？煽紤]使用其他校準(zhǔn)樣品（包括零點(diǎn)或其他錨定點(diǎn)）來(lái)提高曲線(xiàn)擬合的質(zhì)量。
應(yīng)根據(jù)對(duì)準(zhǔn)確度曲線(xiàn)（accuracy profile）的分析，選擇最適當(dāng)和最簡(jiǎn)單的回歸模型（可能應(yīng)用加權(quán)因子，weighting factor）的相關(guān)回歸分析的軟件，作為實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)的一部分，或作為儀器數(shù)據(jù)分析包的一部分，或作為獨(dú)立軟件包都可以提供這樣的數(shù)據(jù)分析。校準(zhǔn)曲線(xiàn)的質(zhì)量以及最終測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量高度地依賴(lài)于校準(zhǔn)樣品的制備過(guò)程、所使用的樣本基質(zhì)的類(lèi)型以及校準(zhǔn)樣品的儲(chǔ)存條件。FDA、EMA、MHLW和ANVISA發(fā)布的機(jī)構(gòu)指南在不同程度上討論了校準(zhǔn)曲線(xiàn)參數(shù)及其性能要求，其中許多要求是相互一致的，但也存在一些差異。
本文旨在描述進(jìn)行回歸模型選擇、校準(zhǔn)曲線(xiàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析的方法，主要目的是幫助讀者開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的生物藥定量分析方法，以支持非臨床和臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。文中花了較大的筆墨詳細(xì)討論的一個(gè)重要內(nèi)容是與編輯校準(zhǔn)曲線(xiàn)的規(guī)范和適當(dāng)規(guī)則有關(guān)。同時(shí)提供了對(duì)于編輯校準(zhǔn)曲線(xiàn)的建議，這些建議遵循科學(xué)上健全，同時(shí)也符合行業(yè)慣例的原則。當(dāng)然，其他方法也可以，如果其科學(xué)性和適用性被證明是可以接受的。
本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來(lái)自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開(kāi)渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
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